劉應(yīng)蛟 楚世峰 胡耀梅 裴剛 周小江 陳乃宏

〔摘要〕 目的 建立中藥玄參中阿魏酸和肉桂酸的HPLC含量測(cè)定方法，觀察其水解前后的變化，以及對(duì)魚藤酮和去血清模型的神經(jīng)保護(hù)作用。方法 采用Agilent 5 TC-C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm，柱溫30 ℃;建立體外魚藤酮及去血清模型，用不同濃度阿魏酸和肉桂酸預(yù)處理，以MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果 阿魏酸和肉桂酸水解前后回收率分別為98.20%和91.41%、97.22%和90.96%，RSD均未超過(guò)2.0%，6批不同產(chǎn)地藥材中阿魏酸和肉桂酸水解前后的含量分別為0.028%～0.041%和0.073%～0.102%、0.035%～0.142%和0.163%～0.336%。阿魏酸（10 μmol/L）可顯著增加去血清和魚藤酮處理細(xì)胞的存活率（P<0.01）;肉桂酸（0.1 μmol/L）能明顯增加魚藤酮處理細(xì)胞的存活率（P<0.05）。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、精密度高、重現(xiàn)性好，為玄參中具神經(jīng)保護(hù)作用的阿魏酸和肉桂酸動(dòng)態(tài)變化提供科學(xué)依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 玄參;阿魏酸;肉桂酸;高效液相色譜;神經(jīng)保護(hù)

〔中圖分類號(hào)〕R284.1;285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.009

中藥玄參為玄參科Scrophulariaceae玄參屬Scrophularia植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。玄參藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，又名“元參”“黑參”等， 歷代藥典都有收載，現(xiàn)收載于2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》一部。其性微寒，味甘、苦、咸，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)功能[1]。玄參為我國(guó)特產(chǎn)，現(xiàn)主要分布于貴州、浙江、陜西、湖南、四川、湖北、江蘇等地。研究發(fā)現(xiàn)玄參含有環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油以及黃酮類等多種成分，環(huán)烯醚萜類含有哈巴苷，哈巴俄苷、8-O-阿魏酰基哈帕苷、6'-O-肉桂?；蛙盏瘸煞?其中苯丙素類含有斬龍劍苷A（6-O-反式肉桂酰基-1-O-α-D-果糖基-β-D-葡萄糖）、ningposide A（3-O-乙?；?2-O-阿魏酰基-α-L-鼠李糖）等;有機(jī)酸類含較多的肉桂酸和阿魏酸等[2]。環(huán)烯醚萜類容易受到光、熱、氧與酶的影響從而氧化或水解;苯丙素類容易在強(qiáng)堿溶液中水解。玄參中環(huán)烯醚萜類和苯丙素類結(jié)構(gòu)中大多數(shù)含有阿魏?；凸鹌；?，水解產(chǎn)物可得到阿魏酸和肉桂酸，如哈巴俄苷發(fā)生水解可生成哈巴苷和肉桂酸[3]。阿魏酸具有抗氧化、抗腫瘤和抗衰老等活性[4]，金蓓蓓等[5]提出阿魏酸具有改善學(xué)習(xí)記憶和保護(hù)腦的作用;肉桂酸是誘導(dǎo)分化劑，能夠誘導(dǎo)分化腫瘤細(xì)胞[6]，曾勝男等[7]認(rèn)為肉桂酸衍生物對(duì)大鼠腦卒中有保護(hù)作用。本文采用RP-HPLC梯度洗脫方法對(duì)不同產(chǎn)地玄參藥材中水解前和水解后的阿魏酸和肉桂酸進(jìn)行含量測(cè)定并比較，并對(duì)其體外神經(jīng)保護(hù)活性進(jìn)行測(cè)定，以期為控制玄參藥材的質(zhì)量和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1? 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260）;電子分析天平（METTLER TOLEDO XS205）;CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速微量冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo）;全功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-TEK）。

1.2? 試藥

阿魏酸（批號(hào)：110773-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%），肉桂酸對(duì)照品（批號(hào)：110786-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%） 均為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。PC12細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)院藥物研究所提供。魚藤酮、MTT、多聚賴氨酸、胰酶來(lái)自美國(guó)Sigma公司;1640完全培養(yǎng)基、FBS、ES、三聯(lián)液來(lái)自美國(guó)HyClone公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純?cè)噭?份不同來(lái)源玄參飲片， 經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為玄參科Scrophulariaceae植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.飲片正品。

2 方法與結(jié)果

2.1? 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm;柱溫30 ℃;流動(dòng)相為 水（A）-乙腈（B），梯度洗脫0～15 min，13%B→13%B;15～20 min，13%B→20%B;20～25 min，20%B→35%B;25～35 min，35%B→70%B;35～40 min，70%B→13%B;流速：1 mL/min;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2? 對(duì)照品混合溶液的制備

精密稱取阿魏酸和肉桂酸對(duì)照品適量， 置棕色容量瓶中加甲醇配制成濃度分別為146.5 μg/mL和86.9 μg/mL的貯備溶液。

2.3? 供試品溶液的制備

2.3.1? 未水解? 取玄參藥材粉末適量，過(guò)3號(hào)篩，稱取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇25 mL，稱重，超聲1 h，再稱重，用甲醇補(bǔ)重，搖勻，濾過(guò)。

2.3.2? 水解? 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下的續(xù)濾液5 mL，水浴蒸干。殘?jiān)?0%氫氧化鈉溶液30 mL 分3 次溶解， 轉(zhuǎn)移回流燒瓶中，水浴回流3 h，放冷。移入分液漏斗中， 用5 mL水洗滌燒瓶，洗滌液并入分液漏斗中，用鹽酸調(diào)pH 2，乙酸乙酯萃取4 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，在50～60 ℃水浴上蒸至近干， 置20 mL容量瓶中用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4? 方法學(xué)考察

2.4.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備? 精密吸取上述對(duì)照品混合溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、6.0 mL分別置10 mL容量瓶中用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，編號(hào)1～6。注入高效液相色譜儀，以對(duì)照品濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，得到阿魏酸的回歸方程為

Y=733 78X+37.186，r=0.999 1

在濃度7.32～87.92 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;肉桂酸的回歸方程為

Y=114 168X+46.237，r=0.999 7

在濃度4.35～52.17 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 分別精密吸取1號(hào)供試品水解前后的溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并于0、1.5、3、6、12、24 h，測(cè)定，根據(jù)阿魏酸和肉桂酸的峰面積，計(jì)算其水解前后的RSD分別為0.78%和0.56%、1.26%和1.60%。

2.4.3? 精密度試驗(yàn)? 分別精密吸取上述1號(hào)對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件，測(cè)定阿魏酸和肉桂酸的含量，重復(fù)6次，分別計(jì)算其RSD為0.72%和0.77%。

2.4.4? 重復(fù)性試驗(yàn)? 取1號(hào)供試品粉末各6份，按照供試品溶液的制備方法“2.3.1”和“2.3.2”進(jìn)行，測(cè)定阿魏酸和肉桂酸的含量，分別計(jì)算其水解前后的RSD為0.52%和1.05%、1.46%和1.39%。

2.4.5? 回收率試驗(yàn)? 精密稱取9份1號(hào)供試品粉末，每份約1 g，分別精密加入對(duì)照品溶液3個(gè)濃度（相當(dāng)于50%、100%、150%濃度水平），平行3份，按照供試品溶液的制備方法“2.3.1”和“2.3.2”進(jìn)行，過(guò)0.45 μm濾膜，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

回收率=（測(cè)得總含量-樣品中含量）/加入量×100%

2.5? 含量測(cè)定

精密稱取各產(chǎn)地玄參粉末（過(guò)三號(hào)篩），按照供試品溶液的制備方法“2.3.1”和“2.3.2”進(jìn)行，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，測(cè)定并計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

2.6? 神經(jīng)保護(hù)活性

2.6.1? 細(xì)胞培養(yǎng)及分組? 將置液氮中凍存的PC12細(xì)胞取出，放入37 ℃下快速解凍并移入15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min并棄去上清。加入完全培養(yǎng)基（含10% ES和5% FBS的1 640培養(yǎng)基）后吹散重懸，移入培養(yǎng)瓶中，置5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液;當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%匯合度時(shí)，倒掉培養(yǎng)液后，用PBS輕輕洗1遍細(xì)胞，然后用0.05%胰酶消化1 min，待細(xì)胞完全消化后用完全培養(yǎng)基終止消化，離心并棄去上清，用完全培養(yǎng)基吹散重懸，穩(wěn)定培養(yǎng)3代。將96孔板中間60孔中，每孔加入100 μL PLL，在37 ℃包被4 h后，用100 μL PBS洗板2次，紫外照射0.5 h，然后稀釋成1×105 個(gè)/mL的細(xì)胞濃度按每孔100 μL鋪板，孵育24 h后用于實(shí)驗(yàn)。分8組培養(yǎng)，每組6孔，設(shè)對(duì)照組、模型組和模型加藥物組，模型加藥物組分別加入0.1、1、10 μmol/L的肉桂酸和阿魏酸。加完后，在培養(yǎng)箱中放置24 h。

2.6.2? 細(xì)胞模型制備? 去血清模型：將完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清1 640培養(yǎng)基;魚藤酮模型：用完全培養(yǎng)基稀釋成4 μmol/L魚藤酮的液體。

2.6.3? MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性? 在藥物處理終止時(shí)，每孔加入10 μL MTT液（用PBS配成5 mg/mL的液體），放在培養(yǎng)箱里4 h，然后再加入三聯(lián)液 100 μL，6～8 h后用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品的OD值[8]。

細(xì)胞相對(duì)存活率=（實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%

如圖2所示，經(jīng)魚藤酮干預(yù)和去血清后，PC12細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，去血清模型中0.1、1、10 μmol/L肉桂酸組的細(xì)胞存活率沒(méi)有明顯變化（P>0.05），10 μmol/L阿魏酸組的細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.01）;而在魚藤酮模型中0.1 μmol/L肉桂酸組能明顯提高細(xì)胞存活率（P<0.05），10 μmol/L阿魏酸組能顯著升高細(xì)胞存活率（P<0.01）。

3 討論

3.1? 流動(dòng)相選擇

分別考察流動(dòng)相甲醇∶0.05%磷酸溶液、乙腈∶0.05%磷酸溶液、甲醇∶水、乙腈∶水，其中以乙腈∶0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，樣品中各峰分離效果最佳。

3.2? 波長(zhǎng)選擇

肉桂酸在203、215、272 nm處，阿魏酸在217、234、290、322 nm處有最大吸收。樣品在217 nm處基線漂移，并且樣品雜峰比較多，272 nm處正好在阿魏酸峰谷附近，因而選取290 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3? 選擇30%、50%、70%和100%甲醇4個(gè)不同濃度進(jìn)行提取，結(jié)果30%甲醇提取的玄參異香草酸峰面積較大，50%甲醇適合于異香草酸、阿魏酸和肉桂酸3者峰面積整體較大，70%甲醇提取的玄參阿魏酸和肉桂酸峰面積較大，由于異香草酸含量比較低，未達(dá)到定量要求，因而選擇70%甲醇提取對(duì)阿魏酸和肉桂酸同時(shí)測(cè)定;對(duì)回流、超聲提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果超聲法提取樣品測(cè)得的峰面積高于回流法;選擇不同超聲提取時(shí)間（1、2、3 h），結(jié)果超聲2 h即能提取完全;同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行未過(guò)夜和過(guò)夜處理，過(guò)夜處理的樣品峰面積約高于未過(guò)夜的1.5倍，因而選擇樣品放置暗處過(guò)夜處理，并且在提取過(guò)程中應(yīng)注意避免陽(yáng)光或者日光燈照射。

3.4? 本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品水解條件采用氫氧化鈉濃度分別為2%，5%和10%，以及水解時(shí)間2.5、3.0、3.5 h，并用稀鹽酸調(diào)pH1、pH2和pH3進(jìn)行比較，結(jié)果10%氫氧化鈉溶液，水解時(shí)間3.0 h，用稀鹽酸調(diào)pH1水解比較徹底。通過(guò)對(duì)比萃取試劑乙醚和乙酸乙酯，由于乙醚為易制毒試劑，并且乙酸乙酯整體上優(yōu)于乙醚，因而乙酸乙酯可以替代乙醚。

3.5? PC12細(xì)胞常用于代替神經(jīng)細(xì)胞的研究，去血清模型是研究神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子剝奪性損傷的病理模型，魚藤酮模型可以特異性地?fù)p傷黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：10 μmol/L阿魏酸在兩種細(xì)胞模型中具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，這與徐富翠等[10]在缺氧培養(yǎng)模型的結(jié)果一致。隨著阿魏酸濃度升高，神經(jīng)保護(hù)作用增強(qiáng)，與黃浩等[11]同樣認(rèn)為不同濃度的阿魏酸對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)作用呈劑量依賴關(guān)系;肉桂酸（0.1 μmol/L）僅在魚藤酮損傷模型中有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，但濃度增強(qiáng)后，保護(hù)作用消失，可能是肉桂酸濃度升高具有一定拮抗性作用，李曉東等[12]研究認(rèn)為低濃度起促進(jìn)，高濃度起抑制的雙重作用。因而阿魏酸和肉桂酸量效關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。為了得到更多的阿魏酸和肉桂酸，可通過(guò)10%氫氧化鈉溶液水解，阿魏酸和肉桂酸含量分別增加2.0～2.6倍和2.6～4.7倍。對(duì)比圖1 B、C中1號(hào)峰水解后含量增加，可能是8-O-阿魏?；蛙眨?''-0-阿魏?；蛙眨瑪佚垊誂等含阿魏酰基的環(huán)烯醚萜類或苯丙素類化合物在受熱或強(qiáng)堿溶液條件下發(fā)生水解，使阿魏酸含量增加。由于C中的3號(hào)峰水解完全，使2、4號(hào)峰含量明顯增加，因?yàn)楣投碥赵趶?qiáng)堿作用下加熱水解為肉桂酸和哈巴苷，通過(guò)比較水解前后肉桂酸含量，發(fā)現(xiàn)水解后肉桂酸含量的增加主要取決于哈巴俄苷含量的高低，極少量可能是通過(guò)其它含肉桂酰基水解而來(lái)。

玄參中主要含有環(huán)烯醚萜類和苯丙素類[13]，其結(jié)構(gòu)中大多數(shù)含有阿魏酰基和桂皮?；猱a(chǎn)物可得到阿魏酸和肉桂酸。綜上所述，通過(guò)10%氫氧化鈉溶液水解可以提高玄參中阿魏酸和肉桂酸含量，對(duì)去血清和魚藤酮模型具神經(jīng)保護(hù)作用，為玄參的質(zhì)量與臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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