張菊華，朱向榮，尚雪波，卞建明，陽(yáng)秀蓮

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南省食品測(cè)試分析中心，湖南長(zhǎng)沙410125；2.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長(zhǎng)沙410125）

純植物油如茶籽油、菜籽油等脂肪酸含量如飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）、多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）有固定的區(qū)間值，難以改變；而植物調(diào)和油可以調(diào)節(jié)不同的原料油比例，有效地改善普通植物油營(yíng)養(yǎng)成分單一的缺點(diǎn)，達(dá)到營(yíng)養(yǎng)均衡的目的[1]。因此，脂肪酸是否均衡是衡量植物調(diào)和油是否營(yíng)養(yǎng)合理的指標(biāo)，調(diào)和油的升級(jí)換代都是以脂肪酸均衡的程度為基礎(chǔ)[2]。目前調(diào)和油消費(fèi)占到了食用油市場(chǎng)的三分之一，其市場(chǎng)份額還在上升，已占到農(nóng)村市場(chǎng)的90%以上。茶籽調(diào)和油，是指包含茶油的2種及2種以上的食用植物油配制而成的食用油脂。據(jù)調(diào)查，市場(chǎng)上茶籽調(diào)和油的包裝上只是標(biāo)注了調(diào)和用油品種，如菜籽油、玉米油、大豆油等，絕大多數(shù)茶籽調(diào)和油并沒有標(biāo)明各油脂所占比例，生產(chǎn)企業(yè)可隨意調(diào)制，這樣存在的問題是沒有從脂肪酸平衡這一根本的營(yíng)養(yǎng)目標(biāo)來生產(chǎn)調(diào)和油。我國(guó)建議膳食油脂所含SFA∶MUFA∶PUFA的比例以（≤0.4）∶1.2∶1為宜[3]，國(guó)內(nèi)研究者開展了一系列基于脂肪酸平衡的營(yíng)養(yǎng)調(diào)和油的調(diào)制[4-6]。因此快速測(cè)定三種脂肪酸含量對(duì)于評(píng)價(jià)茶籽調(diào)和油營(yíng)養(yǎng)有重要意義。

茶籽調(diào)和油脂肪酸含量的測(cè)定方法主要是采用氣相色譜法[7-9]或氣質(zhì)聯(lián)用法[10-11]，色譜法定量成本高，耗時(shí)且對(duì)樣品具有破壞性，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求較高[12]，限制了對(duì)大批量樣本的快速測(cè)定。因此建立茶籽調(diào)和油的脂肪酸含量快速檢測(cè)方法對(duì)于快速評(píng)價(jià)茶籽調(diào)和油品質(zhì)具有重要作用。近紅外光譜法（near infrared spectroscopy，NIRS）具有分析速度快、產(chǎn)出多，不破壞樣品、不用試劑、不污染環(huán)境等特點(diǎn)[13]，在分析測(cè)定中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。王鐸開展NIRS技術(shù)應(yīng)用于大豆及植物油單脂肪酸含量測(cè)定[14]。本研究擬采用NIRS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法測(cè)定茶籽調(diào)和油脂肪酸含量，從而達(dá)到茶籽調(diào)和油質(zhì)量安全科學(xué)監(jiān)管的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GC 2010氣相色譜儀：日本Shimadzu公司；Nicolet AntarisⅡ傅里葉變換近紅外光譜儀：美國(guó)Thermo公司；數(shù)據(jù)處理軟件：Matlab7.8軟件：Mathwork Inc。

37種脂肪酸甲酯混標(biāo)：SIGMA-ALDRICH公司；甲醇（色譜純）：TEDIA公司；異辛烷（色譜純）：KERMEL公司；KOH（分析純）：汕頭市西隴化工有限公司；NaHSO4（分析純）：上海市振興化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本選取

本試驗(yàn)樣本選取從自配的不同調(diào)配比例的二元體系調(diào)和油中選擇樣本28個(gè)（茶油×大豆油6個(gè)、茶籽油×棉籽油6個(gè)、茶籽油×菜籽油6個(gè)、茶籽油×玉米油5個(gè)、茶籽油×棕櫚油5個(gè)），三元體系調(diào)和油樣本56個(gè)（茶籽油×菜籽油×大豆油14個(gè)、茶籽油×菜籽油×棕櫚油14個(gè)、茶籽油×菜籽油×棉籽油14個(gè)、茶籽油×菜籽油×玉米油14個(gè)），多元體系調(diào)和油4個(gè)，市場(chǎng)購(gòu)買的茶籽調(diào)和油樣本13個(gè)，茶籽調(diào)和油樣本總數(shù)共計(jì)101個(gè)。

1.2.2 氣相色譜方法

氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）前處理方法[7]。稱取油樣0.06 g于10 mL具塞試管中，用移液槍移取4 mL異辛烷溶解，再加入2 mol/L的氫氧化鉀甲醇溶液200 μL，蓋上玻璃塞旋渦混合30 s后靜置至澄清。再向溶液中加入1 g硫酸氫鈉，旋渦混合中和氫氧化鉀。待鹽沉淀后，將上層甲酯溶液倒入進(jìn)樣瓶中上GC分析。

GC色譜條件為色譜柱：HP-88（100 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口：260 ℃；柱流速：氮?dú)?1.1 mL/min；程序升溫140℃（5 min）4℃/min 240℃（20 min）；檢測(cè)器FID：250℃；氫氣 40.0 mL/min；空氣 400 mL/min；尾吹30.0 mL/min；分流比 10 ∶1。

1.2.3 近紅外光譜方法

以美國(guó)Thermo公司的Nicolet AntarisⅡ傅里葉變換近紅外光譜儀作為采樣設(shè)備，其配有FOSS公司金反射板的樣品杯，在樣品杯中倒入2 mL的油樣，然后用金反射板小心蓋壓在樣品杯中，以消除氣泡對(duì)光程的影響；近紅外光譜儀采用透反射檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)各個(gè)茶籽調(diào)和油樣本進(jìn)行光譜采集，條件參數(shù)為如下：NIR光譜掃描波數(shù)10 000 cm-1～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率設(shè)為8 cm-1，以內(nèi)置背景為參照。每個(gè)茶籽調(diào)和油樣本進(jìn)行4次平行試驗(yàn)，取其平均光譜作為該樣品的標(biāo)準(zhǔn)光譜。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理軟件

應(yīng)用Matlab 7.1定量分析軟件中的偏最小二乘法（partial least-squares，PLS）進(jìn)行建模。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶籽調(diào)和油樣本近紅外光譜采集

圖1為茶籽調(diào)和油代表性樣本的近紅外光譜圖，記錄了10 000 cm-1～4 000 cm-1波數(shù)下樣本的NIR光譜。油脂中不同脂肪酸所屬的近紅外光譜波數(shù)，飽和脂肪酸位于 5 682 cm-1；C18：1，C18：2 和 C18：3在5 797、5 824、5 868 cm-1處有最大吸收[12]。

2.2 茶籽調(diào)和油脂肪酸含量測(cè)定

圖1 茶籽調(diào)和油樣本的近紅外光譜圖Fig.1 The representative NIR spectrum of camellia blend oil sample

本試驗(yàn)共收集101個(gè)茶籽調(diào)和油樣本，首先按照GB5009.168-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》測(cè)定了樣品中 SFA（C16：0+C18：0）、MUFA（C18：1），PUFA（C18：2+C18：3）的相對(duì)百分含量。37種脂肪酸甲酯標(biāo)樣各組分色譜圖如圖2。

圖2 37種脂肪酸甲酯標(biāo)樣氣相色譜圖Fig.2 The GC chromatography of mixed fatty acid methyl ester standards

2.3 MUFA（C18：1）近紅外模型的建立與結(jié)果分析

2.3.1 光譜預(yù)處理優(yōu)化

采用不處理（None）、均值中心化[15]（mean centering，MC）、多元散射校正[16]（multiple scatter correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換[17]（standard normal variate，SNV）、最大最小歸一化[18]（min-maxnormalization，MMN）、一階導(dǎo)數(shù)法（first derivative，F(xiàn)D）、二階導(dǎo)數(shù)法（second derivative，SD）光譜處理方法，以及幾種預(yù)處理相互結(jié)合，共15種光譜預(yù)處理手段。以訓(xùn)練集預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差（standard error of prediction，SEP） 值和決定系數(shù)（Rc2，coefficient of determination）為模型評(píng)價(jià)指標(biāo)，處理結(jié)果如表1所示。

表1 采用不同光譜預(yù)處理方法得到的預(yù)測(cè)誤差Table 1 Prediction error obtained by different spectral pretreatment methods

續(xù)表1 采用不同光譜預(yù)處理方法得到的預(yù)測(cè)誤差Continue table 1 Prediction error obtained by different spectral pretreatment methods

可以看出，導(dǎo)數(shù)處理前后，SEP值差異不多，主要是由于油脂內(nèi)部基質(zhì)組成復(fù)雜，采用導(dǎo)數(shù)處理，在消除斜坡背景的同時(shí)，噪聲的響應(yīng)值也得到了放大，信噪比下降較多，最終導(dǎo)致了模型結(jié)果較差。SNV可以克服近紅外光譜變量多、共線性強(qiáng)等缺點(diǎn)，消除表面散射以及光程變化對(duì)漫反射光譜的影響[19]，最后確定采用SNV進(jìn)行處理得到最優(yōu)結(jié)果。

圖3為采用SNV處理得到預(yù)測(cè)結(jié)果誤差圖。訓(xùn)練集誤差在PLS主因子數(shù)為11個(gè)時(shí)最小，此時(shí)，SEP值為 1.473，PRESS 為 162.77。

2.3.2 outlier奇異值剔除

圖3 采用SNV處理得到的主因子分析圖Fig.3 The main factor analysis by SNV treatment

奇異值的存在會(huì)在一定程度上影響甚至改變整體數(shù)據(jù)的分布趨勢(shì)，從而影響模型的準(zhǔn)確性，所以奇異值的有效剔除是提高校正模型精度的關(guān)鍵[20-21]。通過交叉驗(yàn)證[22]，確定了11個(gè)主成分為油脂C18：1值PLS模型的最佳主成分。以濃度F值和光譜殘差F值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Haaland法[23]對(duì)C18：1值進(jìn)行奇異值的剔除，結(jié)果如圖4所示。

圖4 訓(xùn)練集outlier整體F比值圖Fig.4 F ratio plot of training set showing outliers

圖 4（a）中，36 號(hào)樣本的 F 值為 4.033，42 號(hào)樣本的F值為1.032，55號(hào)樣本的F值為13.018，均超過了設(shè)定閾值1。圖4（b）中，36、42以及55號(hào)樣本的光譜殘差均超過了設(shè)定值10，所以這3個(gè)樣本是奇異值，予以剔除。

為了驗(yàn)證Haaland法的可靠性，比較異常值剔除前后均方根值（root mean square，RMS）值的變化。未剔除前，訓(xùn)練集的SEP值為1.07，Rc2為0.986，預(yù)測(cè)集的預(yù)測(cè)誤差均方根差（root mean square error of prediction，RMSEP）值為 2.50，Rp2為 0.972；剔除后，訓(xùn)練集 SEP值為0.773，Rc2為0.996，預(yù)測(cè)集RMSEP值為0.768，Rp2為0.999。由此可見，經(jīng)過奇異值剔除處理后，模型的總體誤差都得到了降低，校正性能和預(yù)測(cè)性能均得到了提高，特別是校正模型的誤差幅度。這可能是由于奇異樣本影響了整個(gè)樣本集的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了整個(gè)模型的預(yù)測(cè)精度降低。

2.3.3 預(yù)測(cè)結(jié)果

采用 Kennard Stone（KS）法[24-25]以及 Haaland 法對(duì)C18：1值的進(jìn)行樣本劃分和奇異值剔除，使用SNV對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，建立了C18：1值的PLS模型并進(jìn)行了預(yù)測(cè)。圖5為模型預(yù)測(cè)的決定系數(shù)圖。采用SNV預(yù)處理，預(yù)測(cè)集的RMSEP值與Rp2分別為0.768和0.999，相關(guān)性較好，該方法能夠較好地逼近試驗(yàn)值。

圖5 單不飽和脂肪酸預(yù)測(cè)集相關(guān)圖Fig.5 Correlation plot of predicting set for MUFA

2.4 SFA（C16：0+C18：0）近紅外模型的建立與結(jié)果分析

采用MC處理，利用PLS建模，確定12個(gè)主成分。建模及預(yù)測(cè)如圖6所示。

圖6 飽和脂肪酸訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集相關(guān)圖Fig.6 Correlation plot of training set and predicting set for SFA

此時(shí)，交叉驗(yàn)證均方根（root mean square error of cross validation，RMSECV）=0.232，RMSEP 值為 0.274，訓(xùn)練集決定系數(shù)Rc2為0.999，預(yù)測(cè)集決定系數(shù)Rp2為0.997。

2.5 PUFA（C18：2+18：3）近紅外模型的建立與結(jié)果分析

剔除1個(gè)異常值，采用kennard-stone法對(duì)100個(gè)樣本進(jìn)行劃分，訓(xùn)練集為75個(gè)樣本，預(yù)測(cè)集為25個(gè)樣本。采用MC處理，利用PLS建模，確定12個(gè)主成分。建模及預(yù)測(cè)如圖7所示。

圖7 多不飽和脂肪酸訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集相關(guān)圖Fig.7 Correlation plot of training set and predicting set for PUFA

此時(shí)，RMSECV=0.873，RMSEP 值為 0.963，訓(xùn)練集決定系數(shù)Rc2為0.994，預(yù)測(cè)集決定系數(shù)Rp2為0.995。訓(xùn)練集平均相對(duì)誤差（average relative error，ARE）為2.1%，預(yù)測(cè)集ARE為2.0%。

3 結(jié)論

本文采用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立茶籽調(diào)和油中SFA、MUFA和PUFA含量預(yù)測(cè)的PLS模型，預(yù)測(cè)結(jié)果良好。SFA、MUFA和PUFA預(yù)測(cè)集的 RMSEP 別為 0.274、0.768、0.963，Rp2分別為 0.997、0.999、0.995。研究結(jié)果表明，NIRS法可以作為一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無損的檢測(cè)方法來定量分析油茶籽油中SFA、MUFA和PUFA含量，從而鑒別茶籽調(diào)和油脂肪酸是否平衡，達(dá)到快速評(píng)價(jià)茶籽調(diào)和油品質(zhì)的目的。本研究所建立方法在茶籽調(diào)和油品質(zhì)快速檢測(cè)將具有廣泛的應(yīng)用前景。