張夢珂，杜柏槐，陳紹紅，劉 鈾*

(1.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)生化中心，廣東 湛江 524088)

【研究意義】豬圓環(huán)病毒(PCV)是一種無囊膜包裹、單股負(fù)鏈的DNA病毒，為圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬的重要成員[1]。為深入了解PCV2及PCV2亞型在廣東豬群的流行情況，分析其基因序列的遺傳變異具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】PCV可分為PCV1和PCV2 2個血清型，其中PCV1基因組全長為1759 bp，核苷酸序列同源性大于99 %，對豬無致病性；而PCV2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)等多種病原微生物混合感染，也是導(dǎo)致仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)和免疫機(jī)能抑制的主要原因[2][3]。PCV2基因組全長為1766～1768 bp，包括ORF1和ORF2 2個主要的開放閱讀框。根據(jù)ORF2核苷酸序列的差異，可將PCV2分為a，b，c和d 4個亞型[4]。研究證實(shí)國內(nèi)豬群以PCV2a，PCV2b，PCV2d亞型感染為主[5-8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣東省為養(yǎng)豬大省，而近年來由于PCV2與其他病原微生物的混合感染給養(yǎng)殖戶帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，本研究旨在為豬圓環(huán)病毒病的防治提供科學(xué)依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對同源性的比對和遺傳進(jìn)化樹圖分析猜測可能存在由PCV2b到PCV2d的變異，因此有必要進(jìn)一步研究PCV2基因變異對其致病性與Cap蛋白抗原性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞與病料來源

大腸桿菌DH5α(廣東海洋大學(xué)生化中心)，PK15細(xì)胞(中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)；疑似PMWS病死豬的淋巴結(jié)、脾臟、肺組織來自廣東各地豬場。

1.2 工具酶及主要試劑

RNA/DNA提取試劑盒，DNA Marker，小量質(zhì)粒回收試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，pMD-19T：大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；SacI，HindIII，T4 DNA連接酶：TOYOBO公司產(chǎn)品；蛋白酶K，dNTPs，TaqDNA聚合酶：北京鼎國生物科技公司產(chǎn)品；胎牛血清：Hylcone公司產(chǎn)品；DMEM低糖培養(yǎng)基：Gibco公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG：二抗Jackson公司產(chǎn)品；鼠抗PCV2陽性血清：本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 PCV2的增殖

將疑似PMWS病死豬的淋巴結(jié)、脾臟和肺組織，加入含青霉素和鏈霉素1000 IU/mL的PBS (pH 7.2)勻漿，凍融3次，12 000 r/min離心15 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌，接種PK15細(xì)胞，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)24 h，加入終濃度為作用30 min，PBS潤洗3次，新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲病毒或用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測PCV2。

1.4 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測PCV2

將1.3中感染病毒的PK15細(xì)胞用PBS洗滌3次，預(yù)冷甲醇固定15 min，用含0.05 %吐溫-20 的PBST洗滌3次，5 % BSA封閉2 h，PBST洗滌3次，加入鼠抗PCV2血清，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃避光孵育1 h，PBST洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 病毒DNA的提取

將1.3中感染病毒的PK15細(xì)胞反復(fù)凍融3次，按照大連寶生物工程公司DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA。

1.6 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank收錄的PCV2基因組全序列，用DNAStar 7.0軟件進(jìn)行全基因組核苷酸序列比較，用Primer 5.0在保守區(qū)設(shè)計(jì)兩對特異性的引物。PA1和PA2分別位于445～462 和1768 ～1750 nt，其核苷酸序列為PA1：5′-TGGTGACCGTTGCAGAGC-3′，PA2：5′-AATACTTACAGCGCACTTC-3′，擴(kuò)增片段為760 bp；PB1和PB2分別位于1612～1629和603～586 nt，其核苷酸序列為PB1：5′-TTTTCCTTCTCCAACGGT-3′，PB2：5′-CAGCCCATTTGCTTTTAC-3′，擴(kuò)增片段為1324 bp。

1.7 PCR產(chǎn)物的純化和序列測定

PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖電泳分離，DNA凝膠回收試劑盒純化，交由廣州艾基生物技術(shù)公司測定其核苷酸序列，通過片段拼接得到PCV2全基因組序列。

1.8 基因序列的比較分析

利用DNAStar7.0軟件對PCV2基因組、ORF1和ORF2序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA6.0繪制遺傳進(jìn)化樹，分析比較PCV2廣東分離株與其它有代表性的參考毒株(表1)的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2的分離與鑒定

接種PCV2的PK15細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞生長良好，未見細(xì)胞明顯上浮或病變，用鼠抗PCV2抗體和熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG染色后，可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)亮綠色的小點(diǎn)(圖1A)，而PK15細(xì)胞對照無此現(xiàn)象(圖1B)。經(jīng)IFA鑒定的PCV2分離株分別命名為GD-1、GD-2、GD-3、GD-4和GD-5。

2.2 PCV2分離株基因組的PCR擴(kuò)增

以PA1和PA2、PB1和PB2為特異性引物、5個PCV2分離株基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增獲得大小分別為760 bp的 A片段(圖2A)和1324 bp的B片段(圖2B)，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 PCV2分離株的基因序列分析

5個PCV2分離株中，GD-1和GD-2基因組全長為1767 bp，GD-3，GD-4和GD-5基因組全長為1768 bp。如表2所示，各分離株之間的核苷酸同源性為95.0 %～99.9 %，GD-3和GD-4分離株之間的同源性高達(dá)99.9 %；5個分離株與參考毒株之間的核苷酸序列同源性為93.8 %～100 %，其中GD-1與來自黑龍江的HM038017株核苷酸序列完全相同。

表1 PCV2參考毒株

A：接種PCV2的PK15細(xì)胞；B：PK15細(xì)胞對照A:PK15 cells infected by PCV2 isolates; B:PK15 cells control圖1 IFA檢測PCV2分離株Fig.1 Detection of PCV2 isolates by IFA

A：A片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B：B片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；1～5：PCV2分離株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M：100 bp DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)A:PCR product of A fragment; B:PCR product of B fragment;1-5:PCR amplified products of PCV2 isolates; M:100 bp DNA ladder圖2 PCR擴(kuò)增PCV2分離株基因組片段Fig.2 PCR amplification of gene fragments of PCV2 isolates

表2 PCV2全基因組核苷酸序列同源性比較

注：表2右上半部為PCV2基因組核苷酸序列同源性，左下半部為PCV2基因組核苷酸序列差異。

Note:The upper right part of the table 2 was homology of nucleotide sequences for PCV2 genome and the lower left part was difference of nucleotide sequences for PCV2 genome.

5個PCV2分離株ORF1的核苷酸序列全長為945 bp，編碼315個氨基酸。5個分離株ORF1的核苷酸序列同源性和推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為96.8 %～100 %和99.4 %～100 %；5個分離株與參考株之間的核苷酸與推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為96.5 %～100 %和96.8 %～100 %(表3)。

表3 ORF1的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸酸序列同源性比較

續(xù)表3 Continued table 3

注：表3右上半部為ORF1核苷酸序列同源性，左下半部為ORF1氨基酸序列同源性。

Note:The upper right part of the table 3 were homology of nucleotide sequences for ORF1 and the lower left part was homology of amino acid sequences of ORF1.

5個PCV2分離株中GD-1和GD-2的ORF2的長度為702 bp，編碼233個氨基酸，GD-3、GD-4和GD-5的ORF2的長度均為705 bp，編碼234個氨基酸。5個分離株ORF2的核苷酸序列同源性為89.9 %～99.9 %，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為88.0 %～100 %；5個分離株與參考株之間的核苷酸與推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為86.8 %～100 %和83.7 %～100 %(表4)。

2.4 PCV2的遺傳進(jìn)化分析

由PCV2全基因組核苷酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(圖3)可見，GD-1和GD-2均屬于PCV2d亞型。GD-1與源自陜西的ZJ-38(HM776453)、黑龍江的DBH(HM038017)、湖北的HBsy-21(FJ870972)位于相同的進(jìn)化枝，且遺傳距離較近，GD-2株位于單獨(dú)的進(jìn)化枝，與GD-1遺傳距離較遠(yuǎn)；GD-3、GD-4和GD-5屬于PCV2a亞型，遺傳距離較近。

表4 ORF2的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸酸序列同源性比較

注：表4右上半部為ORF2核苷酸序列同源性，左下半部為ORF2推導(dǎo)的氨基酸序列同源性。

Note:The upper right part of the table 3 were homology of nucleotide sequences for ORF2 and the lower left part was homology of amino acid sequences of ORF2.

圖3 基于PCV2全基因組序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the complete nucleotide sequences of PCV2 genome

圖4 基于ORF2核苷酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the ORF2 nucleotide sequences of PCV2

由ORF2核苷酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(圖4)上來看，GD-1、GD-2與參考毒株ZJ-38、YJ、DBH、HBsy-21位于同一進(jìn)化枝，且遺傳距離較近，均屬于PCV2d亞型；而GD-3、GD-4和GD-5屬于PCV2a亞型，位于單獨(dú)的進(jìn)化枝。

3 討 論

近年來，規(guī)?；i場PCV2感染呈上升趨勢，由此導(dǎo)致母豬繁殖機(jī)能障礙、免疫抑制及仔豬生長發(fā)育不良、衰弱和死亡時有發(fā)生，加上PCV2常與繁殖呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、肺炎支原體等的混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料來看，廣東豬群PCV2感染情況非常普遍[7-8]。本研究結(jié)果顯示，來自廣東不同豬群15份疑似PMWS的組織樣品中，PCV2感染率為33.3 %。

ORF1編碼的Rep蛋白與PCV2在宿主細(xì)胞的復(fù)制有關(guān)。5個分離株ORF1的核苷酸序列同源性和推導(dǎo)氨基酸同源性分別為96.8 %～100 %和99.4 %～100 %，GD-3和GD-4同源性達(dá)到100 %，5個分離株與參考株之間的核苷酸序列同源性與推導(dǎo)的氨基酸同源性分別為96.2 %～100 %和95.9 %～100 %，ORF1基因序列保守性較高。

ORF2編碼的cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是主要宿主保護(hù)性抗原[10]，Cap蛋白個別氨基酸突變可影響其空間構(gòu)象和抗原表位，進(jìn)而影響病毒在宿主細(xì)胞的增殖和致病性[11-12]。本研究分離鑒定的5個PCV2毒株中，GD-1和GD-2的ORF2長度為702 bp，編碼233個氨基酸，GD-3、GD-4和GD-5的ORF2長度均為705 bp，編碼234個氨基酸，其一級結(jié)構(gòu)均含有特征性氨基酸基序86S-N-P-R-S-V91組成的結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)PCV2基因組和ORF2構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)5個PCV2分離株中，GD-1和GD-2屬于PCV2d亞型，與源自湖北、陜西和黑龍江的病毒株親緣關(guān)系較近；GD-3、GD-4和GD均屬于PCV2a亞型，位于獨(dú)立進(jìn)化枝。徐廷川等[7]發(fā)現(xiàn)2007-2011年分離的49個PCV2廣東分屬于PCV2b和PCV2d亞型；嚴(yán)妍等[8]對11個PCV2廣東分離株的基因序列分析證實(shí)其中10個分離株為PCV2b亞型，僅1個為PCV2a亞型。上述差異可能與PCV2分離的地區(qū)不同有關(guān)，但不排除PCV2基因型由PCV2b到PCV2d的變異[7,13]。因此有必要進(jìn)一步研究PCV2基因變異對其致病性與Cap蛋白抗原性的影響，為培育和篩選更為有效的疫苗株奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過對同源性的比對和遺傳進(jìn)化樹圖分析PCV2基因型可能存在由PCV2b到PCV2d的變異，因此有必要進(jìn)一步研究PCV2基因變異對其致病性與Cap蛋白抗原性的影響，為培育和篩選更為有效的疫苗株奠定基礎(chǔ)。