顧力華，楊仁華，陳奇剛，魏丹霞△，余曉玲，陸家龍

(1. 昆明市中醫(yī)醫(yī)院，昆明 650500； 2. 昆明醫(yī)科大學，昆明 650500)

桑芪首烏方是國家級名中老醫(yī)陸家龍主任醫(yī)師的經(jīng)驗方，該方具有補肝腎、旺精血、充髓海、祛瘀通絡(luò)的功效，可治療中風病之肢體偏癱，臨床應(yīng)用數(shù)十年獲得較好療效。本實驗通過由桑芪首烏方制備成的桑芪首烏片，觀察其對大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)后腦缺血-再灌注損傷大鼠腦梗死體積及腦組織形態(tài)病理的影響，以探討該方對腦梗死患者神經(jīng)保護作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物及其配制

桑芪首烏片(主要包括桑寄生、首烏、黃芪等，由昆明市中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供)、天麻鉤藤顆粒、尼莫地平片(20 mg/片)。

桑芪首烏片高劑量組：準確稱取桑芪首烏片14 g加入蒸餾水制成混懸液，定容至100 mL。桑芪首烏片中劑量組：準確稱取桑芪首烏片7 g加入蒸餾水制成混懸液，定容至100 mL。桑芪首烏片低劑量組：準確稱取桑芪首烏片3.5 g加入蒸餾水制成混懸液，定容至100 mL。天麻鉤藤顆粒對照組：準確稱取天麻鉤藤顆粒10 g，加入蒸餾水制成混懸液，定容至100 mL。尼莫地平片對照組：準確稱取尼莫地平片38.5 mg，加入蒸餾水制成混懸液，定容至100 mL。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量 180～220 g，由昆明醫(yī)科大學實驗動物部提供(動物合格證號 SCXK(滇)2012 -0016)。

1.3 主要試劑

多聚甲醛購自天津科密歐化學試劑公司(批號20150828)、水合氯醛購自天津光晨精細化工研究所(批號20150924)、TTC購自美國Biosharp公司(批號40765)。

1.4 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(中國上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.5 方法

1.5.1 MCAO動物模型制備 SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。實驗前動物禁食12 h，自由飲水。參照相關(guān)文獻[1-5]，采用改良線栓法制備MCAO大鼠模型(局灶性腦缺血再灌注模型)。SD大鼠用10%水合氯醛按0.35 ml/100 g(B.W.)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部手術(shù)區(qū)剔毛。沿頸中線切口分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈。用微動脈夾暫時夾閉頸內(nèi)動脈，然后近心端結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈。在頸總動脈距其與頸內(nèi)動脈交叉4 mm 處剪45°斜口，將拴線插入到頸內(nèi)動脈從血管分叉處計算，插入長度18 mm時要放松血管保持原來狀態(tài)，再輕輕往前插，當稍有阻力增大即停止插入。頸內(nèi)動脈打結(jié)，防止線栓滑脫?？p合各層組織，使線的一端露出皮膚約0.5 cm，缺血2 h拔出線栓形成再灌注損傷。假手術(shù)對照組動物僅沿頸中線切口，不分離血管和結(jié)扎。在大鼠清醒后用Bederson評分分級法觀察其神經(jīng)行為學變化，凡評分≥2分者說明造模成功并納入本實驗。

1.5.2 分組及給藥 將造模成功后的大鼠按隨機數(shù)字表法分為MCAO模型對照組、尼莫地平片對照組、天麻鉤藤顆粒對照組、桑芪首烏片高劑量組、桑芪首烏片中劑量組、桑芪首烏片低劑量組、假手術(shù)對照組7組各10只。

造模后24 h內(nèi)開始第1次灌胃給藥，將藥物制成混懸液灌胃。桑芪首烏片高劑量組相當于含生藥16 g/kg，桑芪首烏片中劑量組相當于含生藥8 g/kg，桑芪首烏片低劑量組相當于含生藥4 g/kg，尼莫地平片對照組給予尼莫地平片7.7 mg/kg，天麻鉤藤顆粒對照組給予天麻鉤藤顆粒2 g/kg，MCAO模型對照組和假手術(shù)對照組給予等體積蒸餾水，灌胃容量按10 mL/kg體質(zhì)量計，每天1次，連續(xù)6周。

1.5.3 標本的取樣 實驗結(jié)束即第6周后禁食12 h，將大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉后迅速從后頸處斷頭處死，逐層分離取出大腦，放入4%多聚甲醛中4 ℃保存。石蠟切片前切成2～3 mm厚的小塊，并在不同酒精濃度下脫水，后放入二甲苯2次，65 ℃石蠟，室溫冷卻后切片。

1.5.4 神經(jīng)行為學評分 采用Bederson評分分級法，于術(shù)后當日、術(shù)后第3周、第6周分別對各組大鼠進行神經(jīng)行為學評分并記錄結(jié)果。

1.5.5 大鼠腦梗死體積測定及腦組織形態(tài)病理觀察 取大鼠左側(cè)大腦組織，4%中性甲醛固定、包埋、切片、HE染色，顯微鏡下進行組織學觀察。按冠狀切面順序切5片，每片2 mm，將腦片置于TTC溶液中，放入恒溫振蕩器37 ℃ 30 min充分染色。取出腦片拍照，用顯微圖像分析系統(tǒng)計算梗死面積(粉紅色為未受損的正常腦組織，而梗死區(qū)則因線粒體損害而不染色，呈白色)。腦梗死灶體積(mm3)=總梗死面積(mm2)×腦片厚度(mm)。水腫修正后的腦梗死灶體積(mm3)=梗死體積×對側(cè)半球體積/同側(cè)半球體積。梗塞率(%)=水腫修正后的腦梗死灶體積/雙側(cè)大腦半球體積×100%。

2 結(jié)果

2.1 桑芪首烏片對MCAO大鼠神經(jīng)行為學評分的影響

表1顯示，假手術(shù)對照組大鼠在整個實驗過程中均未出現(xiàn)神經(jīng)行為異常表現(xiàn)，評分均為0分。MCAO模型復(fù)制完成后與假手術(shù)對照組比較，MCAO模型對照組評分明顯增高(P<0.05)，與MCAO模型對照組比較，桑芪首烏片高、中、低劑量組、尼莫地平片對照組、天麻鉤藤顆粒對照組評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥3周后，與假手術(shù)對照組比較，MCAO模型對照組評分明顯增高(P<0.05)，與MCAO模型對照組比較，桑芪首烏片高、中劑量組、尼莫地平片對照組、天麻鉤藤顆粒對照組評分明顯降低(P<0.05)。給藥6周后，與假手術(shù)對照組比較，MCAO模型對照組評分進一步增高(P<0.05)，與MCAO模型對照組比較，桑芪首烏片高、中劑量組、尼莫地平片對照組、天麻鉤藤顆粒對照組評分明顯降低(P<0.05)。

表1 桑芪首烏片對MCAO大鼠神經(jīng)行為學評分影響

2.2 桑芪首烏片對MCAO大鼠腦組織形態(tài)病理的影響

圖1顯示，假手術(shù)對照組細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，細胞核居中，核膜、核仁清晰；MCAO模型對照組細胞排列紊亂，細胞核碎裂、溶解、消失，細胞壞死明顯；尼莫地平片對照組和天麻鉤藤顆粒對照組可以發(fā)現(xiàn)，細胞壞死及細胞排列紊亂，但壞死范圍明顯比MCAO模型組減小；桑芪首烏片高、中、低劑量組隨劑量增加，壞死細胞比MCAO模型組明顯減少。

圖1 各組大鼠腦病理形態(tài)學比較(免疫組化×400)

2.3 桑芪首烏片對MCAO大鼠腦梗死灶大小的影響

圖2表2顯示，與假手術(shù)對照組比較，MCAO模型對照組的梗死體積、修正后梗死體積和梗死率均明顯增高(P<0.05)。給藥6周后，與MCAO模型對照組比較，桑芪首烏片高、中、低劑量組、尼莫地平片對照組、天麻鉤藤顆粒對照組的梗死體積、修正后梗死體積和梗死率均明顯降低(P<0.05)。

圖2 各組腦梗死灶比較

表2 桑芪首烏片對MCAO大鼠腦梗死灶大小的影響

3 討論

腦梗死后導致腦神經(jīng)損傷的過程是一個多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑的復(fù)雜過程。研究認為，腦梗死中腦缺血再灌注損傷表現(xiàn)為腦梗死面積增大、腦組織形態(tài)病理改變及神經(jīng)功能行為異常[6]。雖然當前神經(jīng)保護劑種類繁多，但眾多臨床試驗結(jié)果均為陰性，故神經(jīng)保護劑的研發(fā)成為當前治療腦梗死的難點。

眾多研究表明，復(fù)方中藥具有抗腦缺血再灌注損傷、促進神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。路暢等采用小續(xù)命湯有效成分干預(yù)MCAO大鼠，結(jié)果顯示小續(xù)命湯有效成分高劑量組降低MCAO大鼠腦梗死體積的效果最好，同時能夠明顯減少MCAO大鼠缺血半暗帶和核心區(qū)腦勻漿的過氧化物丙二醛含量和降低一氧化氮合酶活力，提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活力，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[7]。韓寧等認為，肝腎陰虛、氣血衰少是致病之本，擬定了具有益氣填精、榮絡(luò)活血功效的榮絡(luò)健腦飲(人參、鹿茸粉、龜甲、麥冬、菖蒲、川芎、赤芍、大黃、冰片)治療中風。研究結(jié)果表明，榮絡(luò)健腦飲可減輕腦缺血再灌注損傷造成的病理改變，降低腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分，促進腦組織神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維生長因子的表達，減輕腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[8]。

桑芪首烏方是云南省榮譽名中醫(yī)陸家龍主任醫(yī)師臨床應(yīng)用數(shù)十年的經(jīng)驗方。方中桑寄生味苦、性平, 歸肝腎經(jīng)，補腎養(yǎng)血而可益肝腎、強筋骨之功效，偏走于肢體筋脈；制首烏味苦、甘、性微溫，歸肝腎經(jīng)，善補肝腎、益精血，可治療中風病之肢體強急拘攣或筋骨贏弱癱軟諸癥，配伍黃芪等以益氣活血化瘀。諸藥配伍肝腎得補，精血得旺，髓海得充，瘀去絡(luò)通，且滋補而不留邪，降瀉而不傷正，補中有瀉，寓瀉于補。

桑芪首烏片對MCAO大鼠腦組織病理形態(tài)學具有改善作用，同時能減少腦梗死的體積，這可能是MCAO模型大鼠神經(jīng)行為學評分改善的基礎(chǔ)，但桑芪首烏片作用機制還有待進一步的深入研究。