戴銘卉，孔 薇

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210001； 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南京 210001)

慢性腎臟病(CKD)在我國(guó)成人中發(fā)病比率高達(dá)10.8%[1]。隨著Meijers等提出[2]“腸腎軸”概念，揭示腸道微生物的紊亂在CKD病情進(jìn)展中扮演重要角色。CKD患者腸道動(dòng)力下降,潴留的蛋白質(zhì)被腸道致病菌酵解代謝成多種有毒物質(zhì)[3-4],誘導(dǎo)CKD患者體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)CKD的發(fā)展。

大黃是中醫(yī)治療CKD的代表藥物。胡順金[5]等發(fā)現(xiàn)，大黃泄?jié)犷w粒灌腸能改善患者微炎癥狀態(tài)，減少腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。大黃還可改善患者脂質(zhì)代謝功能，調(diào)節(jié)鈣磷代謝,減輕腎損傷[6-7]。通腑泄?jié)岱?生大黃20 g，生槐花30 g，六月雪30 g，蒲公英30 g，生牡蠣30 g，附子10 g)是筆者繼承中醫(yī)腎臟病創(chuàng)始人鄒云翔教授學(xué)術(shù)思想，根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“開鬼門，潔凈府，去菀陳莝”的理論為治療原則，以大黃為君藥，前期研究中發(fā)現(xiàn)其在降低慢性腎臟病3～5期患者腸源性尿毒癥毒素、改善臨床癥狀方面具有療效。本實(shí)驗(yàn)旨在基于“腸腎軸”理論，從腸道生物屏障的角度入手，探討通腑泄?jié)岱綄?duì)CKD大鼠腎功能保護(hù)、改善腸道菌群紊亂及炎癥狀態(tài)的情況，以期進(jìn)一步探明其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑

中藥顆粒劑生大黃、生牡蠣、蒲公英、生槐米、六月雪、附子(江陰天江藥業(yè)有限公司)；金水寶膠囊(江西濟(jì)民可信有限公司)；硫酸吲哚酚標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)；腺嘌呤(美國(guó)AMRESCO公司)；雙歧桿菌(Bifidobacterium longum,1.2186)購(gòu)自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心；大腸桿菌(Escherichiacoli,1.356)購(gòu)自南京市中醫(yī)院藥劑室；E.Z.N.A?.Mag-Bind? Stool DNA Kit試劑盒(美國(guó)OMEGA公司); TGF-β1兔抗大鼠抗體(美國(guó)abcam公司); 兔超敏二步法免疫組化試劑盒、DAB 試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)；大鼠白介素-6ELISA試劑盒(上海西唐生物科技公司)；甲醇(山東瑞星化工有限公司)；乙腈(德國(guó)Merck公司)；三氟乙酸(濟(jì)南瑞?；び邢薰?。

1.2 主要儀器

Waters515型高效液相色譜儀，配717型自動(dòng)進(jìn)樣器、2475型熒光檢測(cè)器(美國(guó)waters公司)；色譜柱：BDS HyPersil C18色譜柱(大連依利特)；實(shí)時(shí)定量PCR儀:ABI 7500；METTLER TOLEDO AL-204電子分析天平(梅特勒儀器上海有限公司) 。

2 方法

2.1 分組、模型復(fù)制與藥物干預(yù)

清潔級(jí)雄性SD大鼠32只，6周齡，體質(zhì)量(180±30)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(浙)2014-0001)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、通腑泄?jié)岱浇M、金水寶組4組各8只，于溫度、濕度恒定的動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

從實(shí)驗(yàn)第 1 天開始，除空白對(duì)照組外其余各組大鼠每日上午灌服腺嘌呤劑量 200 mg/kg/d，至第4周結(jié)束。第4周末每組隨機(jī)抽取2只大鼠，目?jī)?nèi)眥取血檢測(cè)肌酐、尿素水平，提示造模成功[8]。從第5周開始除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠隔日上午灌服腺嘌呤劑量200 mg/kg/d，至第7周結(jié)束。第8周開始各組均停止灌服腺嘌呤，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程所有大鼠進(jìn)水及飲食均不受限制。

實(shí)驗(yàn)開始后第1天根據(jù)組別分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)，根據(jù)徐叔云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物等效劑量法(K=0.018)及6種顆粒劑與生藥材的換算比，給予通腑泄?jié)岱筋w粒劑(生大黃0.6 g·kg-1·d-1，附子0.15 g·kg-1·d-1，生槐花0.54 g·kg-1·d-1，六月雪0.09 g·kg-1·d-1，蒲公英0.36 g·kg-1·d-1，生牡蠣0.045 g·kg-1·d-1)灌胃，每日1次，連續(xù)8周。金水寶組給予中藥灌胃治療，按中國(guó)藥典中6 g/d劑量給藥，根據(jù)徐叔云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物等效劑量法(K=0.018)，則蟲草制劑按照0.54 g/kg/d劑量給予金水寶組大鼠灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

模型組大鼠自實(shí)驗(yàn)開始的第1天，給予蒸餾水灌胃，每天1次，連續(xù)8周。

對(duì)照組大鼠自實(shí)驗(yàn)開始的第1天，給予蒸餾水灌胃每日2次至第4周末。自第5周開始，隔日上午給予蒸餾水灌胃，每天下午給予蒸餾水灌胃，至第7周末。第8周每天下午給予蒸餾水灌胃。

2.2 標(biāo)本收集及觀測(cè)方法

第8周末采集標(biāo)本，提前禁食禁水12 h。0.3 ml ·100 g-110%水合氯醛腹腔注射麻醉，隨后給予腹主動(dòng)脈采血，保存于無肝素采血管中，靜置 20 min，3000 r/min 離心 10 min 后送檢; 采血結(jié)束后摘取腎臟矢狀面剖開， 4% 中性甲醛固定24 h，制作病理切片，HE染色備用。

2.3 生化檢測(cè)

大鼠尿素、肌酐、尿酸、胱抑素c、白介素-6委托南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)。

2.4 硫酸吲哚酚檢測(cè)

采用高效液相色譜-熒光分析法。 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液的制備: 甲醇溶解并定容硫酸吲哚酚鉀鹽對(duì)照品23.71 mg，配得硫酸吲哚酚濃度為800 μg/mL的貯備液，用乙腈稀釋成最終濃度分別為80、40、20、10、5、0.5、0.1 μg/mL的貯備液備用。色譜條件:流動(dòng)相: 磷酸二氫鈉緩沖液(0.1%三氟乙酸,pH2.5)-乙腈(92∶8);流速: 1.0 mL/min; 柱溫: 30 ℃; 樣品溫度: 6 ℃; 檢測(cè)波長(zhǎng): λex=280 nm，λem=390 nm; 樣品處理方法:3000 r /min,10 min分離血清，-20 ℃保存。小心吸取血清 100 μL 于干凈試管中，加入300 μL 0.2%三氟乙酸-乙腈(10∶90)沉淀蛋白，漩渦混勻30 s后離心 (12000 r /min，8 min，4 ℃)，吸取上層清液 200 μL，微孔濾膜濾過后進(jìn)行分析。

2.5 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)及半定量分析法。腎臟組織 TGF-β1采用 SP 二步法: 二甲苯脫蠟水洗，微波爐高火修復(fù)15 min，3% 過氧化氫孵育10 min，滴加一抗[TGF-β1(1∶50)] 4 ℃ 過夜，DAB 顯色。陰性對(duì)照為PBS替代一抗于每次染色。Image-Pro Plus 6.0軟件分析免疫組化方法：每組內(nèi)每張切片連續(xù)挑選6個(gè)400倍視野進(jìn)行拍照，拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性累積光密度值(IOD)。

2.6 腸道菌群檢測(cè)

表1顯示，采用Real-timePCR法，所有研究對(duì)象均給予直腸按摩法收集糞便于密閉滅菌的試管內(nèi),-80 ℃低溫冰箱內(nèi)保存。稱取75 mg糞便用E.Z.N.A?.Mag-Bind? Stool DNA Kit(OMEGA)提取糞便細(xì)菌基因組DNA -20 ℃保存。

換算各標(biāo)準(zhǔn)品1 μL的拷貝數(shù)(長(zhǎng)雙歧桿菌1.46× 1011,大腸桿菌2.16× 1011),用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系10 μL:2×UltraSYBRMixture5μL, 上下游引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 3 μL;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性15 s,T1℃(雙歧桿菌58 ℃、大腸桿菌60 ℃)退火20 s,68 ℃延伸30 s,T2℃(雙歧桿菌85 ℃、大腸桿菌85.5 ℃)保持15 s讀取定量熒光數(shù)據(jù),共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均同時(shí)做3個(gè)平行復(fù)孔。

表1 引物序列

2.7 腎臟病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)

腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)(tubule interstitial fibros is index,TIFI)，TIFI根據(jù)纖維化程度分為4級(jí)(0～3級(jí))。具體評(píng)分方法如下(20倍目鏡下)：10級(jí)：表示無明顯小管間質(zhì)病變；21級(jí)：表示病變程度小于25%；32級(jí)：即灶狀損傷，病變程度25%～75%；43級(jí)：即多灶狀損傷，代表病變程度大于75%，說明分值由低到高，提示腎小管間質(zhì)纖維化由輕到重。以上分析均由未知分組的南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科完成。TIFI=[(1×X1+2×X2+3×X3)/10](X表示病變腎小管間質(zhì)視野數(shù))。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況

空白對(duì)照組大鼠動(dòng)作敏捷，無脫毛，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常，尿量正常，色淡黃，大便成形偏硬，飲水飲食正常，實(shí)驗(yàn)過程中死亡1只； 模型組大鼠漸出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)遲緩，皮毛無光澤，毛量偏少，食欲差，飲水量多，尿量多，大便稀，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。實(shí)驗(yàn)過程中死亡2只；金水寶組整體狀況與模型組比較有改善，實(shí)驗(yàn)過程死亡2只；通腑泄?jié)岱浇M在毛色、精神狀態(tài)、活動(dòng)性、體質(zhì)量方面較模型組明顯改善，實(shí)驗(yàn)過程中死亡2只。

3.2 腸道菌群、炎癥因子及腎小管間質(zhì)纖維化指標(biāo)

表2顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組糞便中大腸桿菌含量明顯升高，雙歧桿菌含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，通腑泄?jié)岱浇M糞便中大腸桿菌含量明顯降低，雙歧桿菌含量明顯升高(P<0.05)，IL-6、TGF-β1含量明顯降低 (P<0.05)， TIFI明顯降低 (P<0.05)；與金水寶組比較，通腑泄?jié)岱浇M糞便中大腸桿菌含量明顯降低(P<0.05)， 雙歧桿菌含量明顯升高(P<0.05)，TIFI明顯降低 (P<0.05)，IL-6、TGF-β1 含量無明顯差異。

表2 通腑泄?jié)岱綄?duì)慢性腎衰竭大鼠雙歧桿菌、大腸桿菌、炎癥因子及腎小管間質(zhì)纖維化的影響

3.3 尿毒癥毒素指標(biāo)

表3顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組血清尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，通腑泄?jié)岱浇M尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C、硫酸吲哚酚含量明顯降低(P<0.05)；與金水寶組比較，通腑泄?jié)岱浇M尿酸、胱抑素C含量明顯降低(P<0.05)，硫酸吲哚酚含量無明顯差異。

表3 通腑泄?jié)岱綄?duì)慢性腎衰竭大鼠尿素、肌酐、尿酸及胱抑素C及硫酸吲哚酚的影響

4 討論

腸道不僅消化食物和吸收營(yíng)養(yǎng)，腸道屏障還能防止腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)，如細(xì)菌和內(nèi)毒素穿過腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)。生物屏障是腸道屏障最主要的組成，腸道生理性菌群則是生物屏障最重要的組成部分。大量研究提示，腸道菌群與慢性腎臟病關(guān)系密切。慢性腎臟病患者腸道微生物發(fā)生了顯著變化，腸道中近200種微生物水平明顯失衡，且細(xì)菌總數(shù)與腎損害程度正相關(guān)，出現(xiàn)大量的機(jī)會(huì)致病菌，共生益生菌群含量下降，機(jī)體免疫功能減弱，腸道屏障功能受損，大量含氮代謝毒素及內(nèi)毒素進(jìn)入循環(huán)，促進(jìn)相關(guān)炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展，最終腎功能損害因此進(jìn)展。本研究表明，CKD大鼠腸道雙歧桿菌屬菌落較空白對(duì)照組大鼠明顯減少，大腸桿菌屬菌落明顯增多，造成這種結(jié)果的原因可能與慢性腎臟病大鼠腸道動(dòng)力下降、腸道內(nèi)益生菌腸道黏附力減弱、定植力異常、蛋白質(zhì)及氨基酸在腸道潴留、腸道內(nèi)含氮物質(zhì)增多有關(guān)。這種腸道微生物環(huán)境紊亂可能導(dǎo)致“保護(hù)性”和“有害性”菌群之間的失調(diào),從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[10]。雙歧桿菌占腸道益生菌總量的85%以上，近年研究顯示CKD大鼠給予雙歧桿菌和乳酸桿菌喂飼后，腸道黏膜的通透性改善，提示上述2種益生菌能夠修復(fù)CKD大鼠腸道黏膜的損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通腑泄?jié)岱侥軌蛎黠@增加CKD大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌含量，降低大腸桿菌含量。結(jié)合腎臟生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，通腑泄?jié)岱娇筛纳艭KD大鼠腎損傷相關(guān)指標(biāo)。通腑泄?jié)岱浇M較模型組硫酸吲哚酚含量有明顯差異，提示通腑泄?jié)岱娇山档痛笫笱逯辛蛩徇胚岱雍?。表明通腑泄?jié)岱綄?duì)此類常規(guī)腎替代療法難以改善的蛋白結(jié)合型尿毒癥毒素的清除具有一定優(yōu)勢(shì)，體現(xiàn)了標(biāo)本并治的原則，達(dá)到了延緩腎損害進(jìn)展的目的。同時(shí)觀察腎臟組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，通腑泄?jié)岱侥軌蜻M(jìn)一步減少腎臟纖維化，金水寶雖也有相同作用，但效果不如通腑泄?jié)岱矫黠@。

Ritz等[11]提出“腸腎綜合征”概念，指出腸道微生物失調(diào)、腸道屏障功能障礙和細(xì)菌易位是造成血液透析患者系統(tǒng)炎癥狀態(tài)的重要原因。研究表明，微炎癥狀態(tài)存在于近半數(shù)終末期腎臟疾病(ESRD)患者中，這是其心腦血管疾病的主要致病因素，且與營(yíng)養(yǎng)不良、貧血及高死亡率存在密切關(guān)系[12-14]。慢性腎臟病患者腸道動(dòng)力減弱，腸道屏障損傷，使得被大量增加的大腸桿菌等革蘭氏陰性菌酵解產(chǎn)生的含氮代謝物及內(nèi)毒素入血，細(xì)菌移位，加速慢性腎衰患者微炎癥狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清IL-6水平較空白對(duì)照組明顯升高，證實(shí)CKD大鼠存在微炎癥狀態(tài)。通腑泄?jié)岱浇M大鼠血清IL-6與模型組具有顯著差異，可明顯改善CKD大鼠的炎癥狀態(tài)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)在CKD發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起重要作用, 可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)和活性等多種途徑引起細(xì)胞外基質(zhì)積聚,抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，加重腎臟損傷,是目前所知作用最強(qiáng)的促纖維化因子[15]。本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠腎臟組織中TGF-β1過度表達(dá)，腎臟間質(zhì)纖維化嚴(yán)重。通腑泄?jié)岱浇M大鼠腎臟組織中TGF-β1表達(dá)減少，腎臟纖維化現(xiàn)象較模型組減輕，表明通腑泄?jié)岱骄哂袦p少腎組織中TGF-β1表達(dá)的作用。

人工培育蟲草菌絲體研制而成的金水寶膠囊廣泛用于慢性腎衰臨床治療，并有良好的療效。金水寶膠囊能一定程度降低尿毒癥代謝毒素，改善炎癥狀態(tài)，延緩腎損傷發(fā)生。但并不能通過調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，進(jìn)而有效抑制CKD的發(fā)生發(fā)展。

本方緊扣“濁毒”病機(jī),結(jié)合傳統(tǒng)方義和現(xiàn)代藥理，以大黃為君藥共襄清熱泄?jié)崂麧裰e。大黃是清熱瀉下的要藥，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，大黃能通過改變游離氨基酸在血漿中的含量，達(dá)到降低血氨及肝臟荷爾蒙生成的目的；機(jī)體氮質(zhì)的再利用率也可因大黃增強(qiáng)谷氨酰胺合成酶的活性而提高；大黃可下調(diào)殘腎代謝率，保存腎單位，控制肌蛋白的分解，增加肌酐和尿素的排泄。同時(shí)，牡蠣有收斂固澀的功效，附子能促進(jìn)血尿素氮的排泄、改善電解質(zhì)紊亂，槐花清熱涼血，蒲公英、六月雪清熱解毒利濕，6藥合用，附子燥熱得制，大黃無瀉下過度之虞。采用中藥顆粒劑使用方便，吸收率高。本研究顯示，通腑泄?jié)岱娇赏ㄟ^調(diào)節(jié)CKD模型大鼠腸道菌群，減輕氧化應(yīng)激，改善炎癥狀態(tài)，減輕腎臟間質(zhì)纖維化，延緩CKD病程發(fā)展。