張仁璇 姜 思 佟少明

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧省植物生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 大連 116081)

Cd2+是具有潛在危害及造成水體污染的非必需重金屬元素之一, 在水環(huán)境中非常穩(wěn)定, 據(jù)統(tǒng)計(jì)人類活動(dòng)和自然界排放到水體中的Cd2+的比例為7∶1, 其在水體中的存在直接影響藻類及其他水生生物, 對整個(gè)水生食物鏈網(wǎng)也具有潛在的威脅[1]。Cd2+對藻細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)為使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化, 葉綠體類囊體的表面體積減小, 并引起多磷酸體、脂內(nèi)含物、藻藍(lán)素顆粒等的數(shù)目與相對體積以及細(xì)胞壁層的體積發(fā)生改變, 線粒體內(nèi)出現(xiàn)大量的密集顆粒等, 進(jìn)而造成藻細(xì)胞一系列生理生化指標(biāo)的改變, 如生物量的減少、色素及蛋白質(zhì)含量下降、酶的活性發(fā)生改變等[2]。

在重金屬的毒理學(xué)研究中, 基于細(xì)胞的生物監(jiān)測手段越來越受到重視[3]。單細(xì)胞微藻由于具有種類多、繁殖快、易培養(yǎng)及敏感性高等特點(diǎn), 經(jīng)常被選擇作為指示生物來監(jiān)測水體質(zhì)量[4], 其中細(xì)胞密度及葉綠素含量等指標(biāo)來反映重金屬對微藻生長的影響, 但這些指標(biāo)的測定存在著測量時(shí)間較長、測量結(jié)果不準(zhǔn)確(微藻的活細(xì)胞和死細(xì)胞較難區(qū)分)等缺陷[5]。近些年發(fā)展起來的通過監(jiān)測微藻光化學(xué)參數(shù)的變化來評價(jià)水體污染程度是解決上述問題的方法之一, 并且此測定方法靈敏度高、可靠性強(qiáng)、省時(shí)省力[6,7]。

紫球藻(Porphyridium purpureum)是一種極具研究價(jià)值的真核單細(xì)胞紅藻, 細(xì)胞形態(tài)呈圓形或卵形, 培養(yǎng)時(shí)受到溫度、光照強(qiáng)度、光暗周期以及酸堿度的影響。紫球藻含有豐富的藻紅蛋白可與藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和葉綠素a在葉綠體類囊體薄膜上按一定次序排布形成藻膽體, 用于光合作用中光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化[8]。本研究以紫球藻作為研究材料, 探究了不同濃度梯度的Cd2+在不同處理時(shí)間內(nèi)對紫球藻的生長、葉綠素a、藻紅蛋白和ATP含量的影響, 以及通過光合參數(shù)Fv/Fm、YII、ETR及NPQ的規(guī)律變化明確了Cd2+對紫球藻光化學(xué)活性的影響, 對于利用紫球藻分析Cd2+及其他重金屬污染的特性具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

紫球藻的液體藻種為遼寧師范大學(xué)植物生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的弱光低溫保存種, 擴(kuò)大培養(yǎng)采用f/2液體培養(yǎng)基, 在光照強(qiáng)度為35 μmol photons/(m2·s),溫度25℃, 光周期為16h∶8h(L∶D)的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

1.2 Cd2+脅迫對紫球藻生長的影響

配制Cd2+終濃度分別為0、50、100、200、500、1000 μmol/L的f/2液體培養(yǎng)基, 將預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)生長期的紫球藻, 以接種量(5×104個(gè)/mL)分別接入含上述Cd2+濃度的50 mL f/2培養(yǎng)基中, 放置光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng), 每天間斷搖動(dòng)3—4次。在培養(yǎng)的6d內(nèi)每天取藻液2 mL, 稀釋后, 采用血球計(jì)數(shù)板來測定藻細(xì)胞密度。

1.3 Cd2+脅迫對紫球藻葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

Cd2+處理紫球藻及接種如上所述, 接種后的6d內(nèi), 每天采用Multi-color-PAM(WalZ, Gemany)各種處理的紫球藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù), 包括Fv/Fm、YII、ETR和NPQ, 測定方法完全按照儀器提供的操作規(guī)程進(jìn)行。

1.4 Cd2+脅迫對紫球藻藻紅蛋白含量的影響

紫球藻藻紅蛋白的含量測定參考Kursar等的方法[9], 具體操作為:取不同濃度Cd2+處理6d后的紫球藻50 mL, 25℃, 5000 r/min離心10min, 棄上清, 得到藻體后加入10 mL ddH2O, 洗滌藻體, 25℃, 5000 r/min離心10min, 棄上清; 加入10 mL磷酸緩沖液(10 mmol/L、pH 7.0)洗滌藻體, 上述條件離心, 棄上清; 將藻體重懸于10 mL磷酸緩沖液中; –80℃冷凍1h, 40℃解凍, 反復(fù)凍融3次, 對藻體重懸液進(jìn)行超聲破碎,超聲5s, 停止5s, 持續(xù)5min; 鏡檢藻體, 超過90%藻體破碎后, 4℃, 5000 r/min離心10min, 收集上清液于新管中。以磷酸緩沖液作為空白對照, 用紫外分光光度計(jì)測定OD545值。藻紅蛋白含量采用藻紅蛋白(mg/mL)=A545×154公式計(jì)算。

1.5 Cd2+脅迫對紫球藻ATP含量的影響

ATP含量測定參照碧云天ATP檢測試劑盒提供的方法略加改動(dòng), 具體操作為先取2 mL圓底離心管, 標(biāo)記并稱重。每管中加入不同濃度Cd2+處理5d后的紫球藻1.5 mL, 25℃, 5000 r/min離心10min,棄上清, 再次稱重。每管中加入100 μL裂解液, 破碎勻漿后, 4℃, 12000 r/min離心10min, 取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

ATP濃度測定:向檢測孔內(nèi)加入100 μLATP檢測工作液(碧云天, 江蘇), 室溫孵育3—5min。向檢測孔內(nèi)加入10 μL樣品或者ATP標(biāo)準(zhǔn)品, 迅速混勻,間隔2s后, 用Mikrowin 2000測定熒光值。通過ATP標(biāo)準(zhǔn)品建立ATP濃度(μmol/L)和熒光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 進(jìn)而計(jì)算出待測樣品中ATP的實(shí)際濃度。

2 結(jié)果

2.1 Cd2+脅迫對紫球藻的生長的影響

在不同濃度的鎘離子處理6d內(nèi), 每天監(jiān)測紫球藻生物量(圖1), 紫球藻的細(xì)胞密度隨Cd2+濃度增加而降低, 濃度越高, 生長越緩慢; 到第6天時(shí), 各處理濃度的生長量分別為同期未處理組的94.2%(P＞0.05,50 μmol/L)、90%(P＜0.05, 100 μmol/L)、68%(P＜0.01, 200 μmol/L)、17.9%(P＜0.01, 500 μmol/L)及14.9%(P＜0.01, 1000 μmol/L)。

圖1 Cd2+對紫球藻生長的影響Fig. 1 The effect of Cd2+ on the growth of P. purpureum

2.2 Cd2+脅迫對紫球藻光化學(xué)活性的影響

采用用Multi-color-PAM監(jiān)測了Cd2+處理后紫球藻的PSII的最大光量子產(chǎn)額(Fv/Fm)、實(shí)際光化學(xué)效率(YII)、相對電子傳遞效率(ETR)和非光化學(xué)淬滅光化學(xué)活性(NPQ)在6d內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化情況。

如圖2A所示,Fv/Fm在低于200 μmol/L的Cd2+處理后, 呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢, 處理后的第6天, 50 μmol/L Cd2+處理的Fv/Fm值仍然高于未處理組, 而100 μmol/L及200 μmol/L的Cd2+處理的Fv/Fm值急劇下降, 表明Cd2+濃度為100 μmol/L時(shí)就可以對PSII系統(tǒng)造成傷害; 500及1000 μmol/L濃度的Cd2+處理,Fv/Fm值一直呈現(xiàn)下降的趨勢, 到第6天時(shí), 分別為0.0375和0.038, 與未處理組的0.3435相比, 下降了近89%, 表明藻細(xì)胞的PSII反應(yīng)中心已經(jīng)完全遭到了破壞, 失去原有功能, 藻細(xì)胞無法進(jìn)行光合作用, 大部分細(xì)胞已經(jīng)死亡。

如圖2B所示,YII的值在低于200 μmol/L的Cd2+處理后, 呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢, 到第6天時(shí),50和100 μmol/L Cd2+處理的YII值與未處理組相比,沒有顯著差異; 500和1000 μmol/L濃度的Cd2+處理使YII值一直處于持續(xù)下降中, 處理后的第6天的YII值分別為0.052和0.021, 與未處理組0.2295相比,分別下降了77%及91%, 表明在此時(shí)的Cd2+濃度已經(jīng)使紫球藻的光合效率已經(jīng)降到最低, 無法通過光合作用提供藻細(xì)胞生長所需的能量。

如圖2C所示, ETR值在低于200 μmol/L的Cd2+處理后, 先下降后逐漸上升, 至第6天時(shí), 50、100及200 μmol/L Cd2+處理與未處理組無顯著差異;500和1000 μmol/L的Cd2+處理至第6天的ETR值分別為0.4和0.3, 與未處理組3.5相比, 分別下降了89%和91%, 表明光合電子傳遞幾乎接近于停止。

圖2 Cd2+脅迫處理對紫球藻光活學(xué)活性的影響Fig. 2 The effect of Cd2+ stress on the photochmecial activity of P. Purpureum

如圖2D所示, NPQ的值在低于200 μmol/L的Cd2+處理后的第3天起, 就顯著高于未處理組, 到第6天3種濃度的處理分別比未處理組高2.23倍、2.39倍及2.22倍, 表明此時(shí)細(xì)胞在受到Cd2+脅迫后,能夠通過NPQ方式耗散所吸收的過剩光能; 500和1000 μmol/L的處理的NPQ值一直處于下降之中, 表明此時(shí)細(xì)胞由于PSII的失活造成紫球藻的正常生理功能被嚴(yán)重破壞, 已經(jīng)無法通過NPQ的方式來耗散所吸收的光能。

2.3 Cd2+脅迫對紫球藻葉綠素a及藻紅蛋白含量的影響

在不同濃度的Cd2+處理6d后, 隨著處理濃度的增加, 紫球藻的葉綠素a及藻紅蛋白的含量顯著下降(圖3), 且濃度越高, 下降的輻度越大。在各濃度Cd2+處理6d后, 葉綠素含量分別是未處理組的68%(P＜0.01, 50 μmol/L)、59.7% (P＜0.01, 100 μmol/L)、43.1% (P＜0.01, 200 μmol/L)、8.9% (P＜0.01, 500 μmol/L)及7.3% (P＜0.01, 1000 μmol/L); 藻紅蛋白的含量分別是未處理組的83.6% (P＜0.05, 50 μmol/L)、76.4%(P＜0.01, 100 μmol/L)、62.8% (P＜0.01, 200 μmol/L)、6.1% (P＜0.01, 500 μmol/L)及5.8% (P＜0.01, 1000 μmol/L), 相比之下, 葉綠素a下降的速度要比藻紅蛋白快速。以上結(jié)果也可以看出, 在超過500 μmol/L的Cd2+作用下, 絕大部分葉綠素a和藻紅蛋白已經(jīng)降解, 也是光化學(xué)活性下降的主要原因之一。

2.4 Cd2+脅迫對紫球藻ATP含量的影響

在不同濃度的Cd2+處理6d后, 隨著處理濃度的增加, ATP的含量顯著下降(圖4), 且濃度越高, 下降的輻度越大, ATP含量分別是未處理組的67.1%(P＜0.01, 50 μmol/L)、61.9% (P＜0.01, 100 μmol/L)、44.5% (P＜0.01, 200 μmol/L)、30.3% (P＜0.01, 500 μmol/L)及19.8% (P＜0.01, 1000 μmol/L)。

圖3 Cd2+脅迫處理對紫球藻葉綠素a及藻紅蛋白含量的影響Fig. 3 The effect of Cd2+ on the content of chlorophyll a and phycoerythrin of P. purpureum

圖4 Cd2+脅迫處理對紫球藻ATP含量的影響Fig. 4 The effect of Cd2+ stress on the content of ATP of P.purpureum

3 討論

水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡是生態(tài)學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域, 水體中的重金屬污染是主要的環(huán)境問題之一, 微藻作為水生生態(tài)系統(tǒng)的主要初級生產(chǎn)力, 重金屬的污染對其生長及發(fā)育會(huì)產(chǎn)生極大的影響。重金屬對藻類的毒性強(qiáng)弱與重金屬的種類、濃度、環(huán)境因素等有關(guān), 同時(shí)也因藻類的不同而各異[8]。葉綠素含量是常用來評價(jià)藻類受到傷害時(shí)的生理指標(biāo)之一, 重金屬脅迫對葉綠素含量的影響會(huì)因重金屬的種類及藻類不同而異, 一般而言, 低濃度的必需重金屬的脅迫會(huì)促進(jìn)葉綠素的積累, 而高濃度必需重金屬或非必需重金屬脅迫會(huì)降低葉綠素的含量。如Ni2+和As3+脅迫會(huì)顯著降低銅綠微囊藻中葉綠素a含量[10]; 輪藻在不同重金屬離子作用下葉綠素含量明顯降低, 其影響的強(qiáng)弱順序依次為Cr6+、Cd2+、Hg2+和Pb2+[11]; 對于必需重金屬Zn2+而言, 低濃度(＜3 mg/L)會(huì)促進(jìn)鞘藻葉綠素的合成, 高濃度(＞20 mg/L)會(huì)降低鞘藻葉綠素的含量[12], 而低于1 mg/L的Zn2+濃度, 會(huì)提高柵藻葉綠素a含量, 而Zn2+濃度高于5 mg/L時(shí), 柵藻葉綠素a含量會(huì)降低[13]。在本研究中, 紫球藻的葉綠素a的含量在高于50 μmol/L的Cd2+脅迫處理時(shí), 葉綠素a的含量就顯著下降, 且隨著處理濃度的提高, 下降的幅度增大。

藻膽蛋白作為光合作用的捕光色素復(fù)合體, 主要存在于紅藻、藍(lán)藻、隱藻和少數(shù)甲藻中, 用于光能的吸收和傳遞[14]。紫球藻作為真核單細(xì)胞紅藻,其光合色素主要有葉綠素a和藻紅蛋白。在本研究中, 紫球藻在受Cd2+脅迫后, 培養(yǎng)液顏色隨Cd2+濃度升高而逐漸紅色變淺, 直至變白, 結(jié)合藻紅蛋白含量測定結(jié)果表明, Cd2+通過破壞藻紅蛋白結(jié)構(gòu), 從而降低原初反應(yīng)中光能的吸收和傳遞, 抑制紫球藻的光合作用, 因此藻紅蛋白是紫球藻受到Cd2+脅迫的一個(gè)重要作用位點(diǎn)。

ATP是生物體內(nèi)最重要的高能化合物之一, 為生命活動(dòng)的提供直接能源, 因此生物細(xì)胞體內(nèi)的ATP含量水平反映了細(xì)胞的活性。對于真核藻類而言, ATP能量供應(yīng)主要來源于呼吸作用的氧化磷酸化和光合作用的光合磷酸化過程。重金屬Cd2+、Hg2+及Co的脅迫會(huì)損傷細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu), 致使細(xì)胞核變形, 線粒體膨大和解體及葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)破壞[15,16]。在本研究中, 紫球藻細(xì)胞內(nèi)的ATP含量隨Cd2+濃度增加而顯著下降, 這可能也是由于Cd2+作用于線粒體及葉綠體的類囊體片層等結(jié)構(gòu),使其功能受損或結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞, 使得ATP合成受阻, ATP含量下降, 從而影響藻細(xì)胞的活性。

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測中, 通過測定能進(jìn)行光合作用藻類的Fv/Fm、YII、rETR、International Journal ofNPQ等光合參數(shù)變化, 來反映外界環(huán)境因子的變化。如在Cu2+、Zn2+、Cd2+脅迫下纖細(xì)角毛藻、三角褐指藻及杜氏鹽藻的Fv/Fm、YII、rETR和qP等參數(shù)值的變化與重金屬離子濃度和脅迫時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)[5]。Fv/Fm為PSII的最大光量子產(chǎn)額, 反映了PSII反應(yīng)中心完全開放時(shí)所能吸收的最大量子產(chǎn)額,Fv/Fm值的大小隨著生存的外界環(huán)境的變化而變化, 但當(dāng)藻類受到脅迫后, 該值一般會(huì)隨著脅迫程度的增加而下降, 在某種程度上Fv/Fm值的大小能夠反映紫球藻PSII的功能是否受損。紫球藻在受到Cd2+脅迫時(shí), 高于500 μmol/L的Cd2+脅迫時(shí)會(huì)使Fv/Fm值急劇下降, PSII反應(yīng)中心受損、原初反應(yīng)受抑制, 因此紫球藻是無法在高于500 μmol/L鎘離子的環(huán)境中生存;ETR為PSII相對電子傳遞效率,與放氧光合速率和CO2的固定速率具有良好的線性關(guān)系, 高于500 μmol/L的Cd2+的脅迫會(huì)嚴(yán)重抑制電子傳遞鏈的電子傳遞, 從而影響紫球藻的光合效率;NPQ為非光化學(xué)淬滅, 表示PSII捕光色素捕獲的光能以熱能形式耗散的份額的大小, 可保護(hù)光合結(jié)構(gòu)不受強(qiáng)光所破壞, 是植物體的進(jìn)行自我保護(hù)的一種機(jī)制, 當(dāng)紫球藻受到低于200 μmol/L的Cd2+脅迫時(shí),細(xì)胞還可以通過NPQ方式來耗散部分能量, 避免光合結(jié)構(gòu)受到損傷壞, 而在高于500 μmol/L的Cd2+脅迫下, NPQ值持續(xù)下降到最低點(diǎn), 已經(jīng)不能通過NPQ方式來耗散吸收的光能, 完全喪失了自我保護(hù)的機(jī)制。因此, 重金屬Cd2+對紫球藻光化學(xué)活性的影響主要表現(xiàn)在PSII反應(yīng)中心受損, 電子傳遞過程受阻, 光合效率降低, 在低濃度的Cd2+脅迫下, 細(xì)胞可以通過NPQ途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞所吸收的過剩光能,但在高濃度的Cd2+脅迫下, 隨著PSII光系統(tǒng)等各種膜結(jié)構(gòu)的解體及細(xì)胞復(fù)合物的降解, 相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制也會(huì)失去。

綜合本研究結(jié)果, 各濃度梯度的Cd2+脅迫, 會(huì)使紫球藻的生長速度顯著下降, 葉綠素顯著減少, ATP含量顯著減少, 且濃度越高減少的幅度越大; 紫球藻的光化學(xué)參數(shù)Fv/Fm、YII、ETR對金屬Cd2+脅迫反應(yīng)與重金屬的濃度呈顯著的負(fù)相關(guān), 可以利用這些光化學(xué)參數(shù)的變化來反映紫球藻受重金屬的脅迫的程度, 并可作為篩選抗重金屬的微藻品種的參考指標(biāo)。