岳陳陳 丁 巍 李 濤 趙 鵬 徐軍偉 余旭亞

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 昆明 650500)

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種單細胞綠藻[1], 在生物或非生物脅迫下能夠積累蝦青素, 含量最高可達細胞干重的4%[2], 高于其他已知的蝦青素來源。蝦青素(3, 3′-二羥基-β, β-胡蘿卜素-4, 4′-二酮)是一種紅色酮類胡蘿卜素, 有13個單雙鍵交替排列的共軛鍵, 因此具有強抗氧化性、中和自由基、清除活性氧的特性[3,4], 廣泛應(yīng)用在食品、飼料、化妝品以及醫(yī)藥行業(yè), 具有較高的商業(yè)價值[5,6]。然而, 蝦青素生產(chǎn)中卻存在著生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低等問題, 因此, 采用有效策略提高雨生紅球藻蝦青素產(chǎn)量成為研究的熱點。

褪黑素(Melatonin, MLT)是一種廣泛存在于生物界的激素, 在動物、植物以及微生物中均已發(fā)現(xiàn),先前研究表明MLT具有降低細胞內(nèi)活性氧、清除自由基、調(diào)節(jié)生物周期節(jié)律、信號分子和光合作用等功能[7—9], 從而對生物體代謝途徑進行調(diào)控。研究顯示雨生紅球藻在脅迫條件如高光照、缺氮等[10,11]條件下, 有利于蝦青素的積累。另外, 脅迫條件下細胞內(nèi)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS), 作為信號分子參與生物系統(tǒng)的信號通路[12—14]; 一氧化氮 (Nitric oxide, NO)和水楊酸(Salicylic acid, SA)是植物中的信號分子, 參與固有的防御體系, 應(yīng)對不利的生長條件[15,16]。雨生紅球藻蝦青素的生物合成開始于2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途徑, 以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸(GA3P)為起始物, 經(jīng)第一個限速酶, 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)催化, 形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP), 用于后續(xù)的蝦青素合成,dxs基因表達量的增加可提高DOXP的生成量, 進而促進蝦青素的合成[17]。研究發(fā)現(xiàn)MLT能大幅提高單針藻中油脂含量, 而油脂和蝦青素都是微藻的次級代謝產(chǎn)物且合成又聯(lián)系密切[18,19], 這為本研究將MLT用于雨生紅球藻誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素提供了理論依據(jù)。

本研究選用MLT對雨生紅球藻進行誘導(dǎo), 檢測MLT對生長、蝦青素積累、信號分子以及蝦青素合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達量的影響, 進而對MLT誘導(dǎo)蝦青素合成的機制進行分析探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻由本實驗室篩選、保存。MLT: 上海生工生物工程股份有限公司; 活性氧檢測試劑盒、總一氧化氮檢測試、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒: 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;SA檢測試劑盒: 美國Bio Vision公司; 甲醇、DMSO(均為分析純): 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;丙酮: 重慶川東化工(集團)有限公司; KOH: 重慶北碚化學(xué)試劑廠; 二氯甲烷: 天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XS-212-202顯微鏡: 江南光電(集團)股份有限公司; 1730R高速冷凍離心機: 丹麥Labogene Scanspeed公司; FA2004N分析天平: 上海箐海儀器有限公司; DS-8510DTH超聲波微波組合體系: 上海生析超聲儀器有限公司; Ultrospec 2100pro紫外可見分光光度計: 安瑪西亞(中國)有限公司; HHW-D6水浴鍋: 金壇雙捷實驗儀器廠; VS-840-1超凈工作臺: 上海博訊實業(yè)有限公司; LDZX-50KBS滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠; 5804R離心機: 德國Eppendorf公司; FD5-12冷凍干燥機: 西盟國際集團; 熒光定量PCR儀: 美國伯樂公司; 高效液相儀: waters 996。

1.3 方法

雨生紅球藻的培養(yǎng)選用Bold’s Basal Medium(BBM)[20]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 將純化過的雨生紅球藻轉(zhuǎn)接到3 L(內(nèi)置2 L培養(yǎng)基)錐形瓶中, 控制培養(yǎng)溫度(25±1)℃, 光照強度50 μE/(m2·s), 持續(xù)通入0.1 vvm的無菌空氣, 培養(yǎng)至對數(shù)生長期(此時生物量約為7×105cells/mL)。

將MLT誘導(dǎo)MLT溶于乙醇中配制成濃度為0.21 mol/L的MLT母液, 備用。將細胞液培養(yǎng)至對數(shù)生長期5000×g離心3min收集細胞, 用無菌水洗滌3次, 除去殘留培養(yǎng)基, 重懸浮于缺氮的BBM培養(yǎng)基中, 配成體系為350 mL生物量為2.5×105cells/mL的光生物反應(yīng)器, 使誘導(dǎo)培養(yǎng)基的MLT濃度為0、5、10和15 μmol/L(保持加入相同的乙醇), 每個梯度設(shè)置3個平行樣。控制培養(yǎng)溫度(27±1) ℃, 216 μE/(m2·s)持續(xù)光照, 連續(xù)通入0.04 vvm的無菌空氣培養(yǎng)15d, 進行隔天取樣, 測定藻細胞生物量以及蝦青素積累量, 同時取樣用于后續(xù)的NO、SA和ROS的測定。

測定細胞生物量和蝦青素含量采用高效液相法測定雨生紅球藻蝦青素的含量。隔天定期取50 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的藻液, 5000 r/min離心3min, 棄上清收集藻細胞, 使用超純水洗三次, 加入5 mL甲醇-二氯甲烷(3∶1)提取液, 冰水浴下用勻漿機2800 r/min勻漿20s, 勻漿液10000×g低溫離心15min, 轉(zhuǎn)移上清至另一試管中。重復(fù)提取2—3次,至沉淀物基本呈現(xiàn)無色為止。將收集的所有提取液10000×g再次低溫離心15min, 取上清用高效液相色譜儀測定, 色譜柱為C18柱(waters, 25 cm×4.6 mm,5 mm)流動相A(丙酮)和流動相B(甲醇∶水=9∶1,v/v)遵循: 25min B 80%—20%, 10min 20% B, 5min B 20%—80%, 流速為1.25 mL/min; 檢測器為waters 996光電二極管陣列檢測器, 進樣量30 μL測定波長476 nm, 積分得到蝦青素質(zhì)量濃度 (mg/L)。

此外, 每隔一天定期取10 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的藻液, 離心收集細胞, 冷凍, 干燥, 稱重, 細胞生物量和蝦青素含量按以下公式計算:

同時, 分別計算出游離蝦青素和蝦青素酯的含量。

細胞內(nèi)ROS、NO和SA含量測定和抑制劑處理將收集的樣品按照Che等[21]的方法使用活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測定細胞內(nèi)活性氧的含量。測定內(nèi)源的SA和NO水平,離心收集所取樣品并水洗2次, 磨碎藻細胞, 使用水楊酸檢測試劑盒(Bio Vision, America)和總NO檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測定細胞內(nèi)SA和NO的水平。

為了測定在脅迫條件下MLT與NO、ROS以及SA之間的關(guān)系, 將微藻分別培養(yǎng)在含有10 μmol/L MLT+200 μmol/L carboxy-PTIO (NO清除劑)、10 μmol/L MLT+100 μmol/L paclobutrazol (PAC,SA抑制劑)和10 μmol/L MLT+10 mmol/L N-acetyl-L-cysteine (NAC, ROS清除劑)的缺氮BBM培養(yǎng)基中, 隔天取樣, 測定蝦青素含量。

雨生紅球藻dxs基因表達分析本試驗使用Primer5.0設(shè)計、上海生工合成dxs酶基因上下游擴增引物: 5′-ACAACCAGCAGGTGTCGC-3′與5′-CCGTCTCCGCACTCTTCA-3′, 擴增出序列后測序,以此為模板設(shè)計熒光引物dxsF (5′-GTCTCCGCAC TCTTCACC-3′)與dxsR (5′-CCCACCCAGTACA ACAAC-3′), 用Trizol法提取不同濃度MLT處理的微藻RNA, 采用RT-PCR法檢測dxs酶基因的表達量,以18S (引物: 5′-CGGTCTGCCTCTGGTATG-3′與5′-GCTTGCTTTGAACACGCT-3′)基因作為內(nèi)標(biāo)來調(diào)節(jié)RNA的用量和循環(huán)數(shù), 使內(nèi)標(biāo)基因在不同濃度誘導(dǎo)下的表達豐度一致。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗重復(fù)了5次, 每次均設(shè)置3個平行樣, 所有圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差, 使用ANOVA(SPSS 19.0)一步法分析實驗數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進行多重比較檢驗調(diào)查不同試驗的組間差異, 圖中“*”表示同一時間與其他組差異顯著(P＜0.05);“**”表示同一時間與其他組差異極顯著(P＜0.01)。

2 結(jié)果

2.1 MLT對微藻細胞生物量的影響

雨生紅球藻在誘導(dǎo)條件下生物量會發(fā)生變化,為了探究外源添加MLT對雨生紅球藻生長的影響,測定了不同濃度不同時間微藻的生長情況, 如圖1所示, 所有組在誘導(dǎo)條件下的生長情況不同, 培養(yǎng)15d后, 對照組生物量達到了0.77 g/L, 15、10和5 μmol/L MLT處理濃度的細胞量峰值分別達到0.62、0.69和0.64 g/L, 低于對照組, 根據(jù)生物量的變化趨勢可知, 15 μmol/L MLT誘導(dǎo)組有明顯的下降趨勢。這一現(xiàn)象表明低濃度的MLT處理對H.pluvialis生長沒有促進作用, 而高濃度的MLT處理抑制微藻細胞的生長。

圖1 不同濃度的MLT對微藻生長的影響Fig. 1 Effects of MLT on the biomass of H. pluvialis during induction process

2.2 MLT對雨生紅球藻蝦青素積累的影響

由圖2可知, 在誘導(dǎo)條件下不同濃度的MLT對細胞內(nèi)蝦青素積累影響存在差異, 蝦青素積累量與MLT間存在明顯的劑量效應(yīng), MLT處理組中,MLT濃度為10 μmol/L時蝦青素含量顯著增加, 而在其他濃度處理組蝦青素含量沒有明顯變化。10 μmol/L MLT處理組在開始誘導(dǎo)9d后蝦青素積累開始顯著增加, 13d時蝦青素積累量達到最大(31.32 mg/g), 是對照組(13.27 mg/g)的2.36倍。在MLT濃度為5和15 μmol/L時, 蝦青素的最大積累量分別為15.41和7.86 mg/g, 可能是高濃度的褪黑素抑制蝦青素的積累。10 μmol/L的MLT處理雖然對微藻生物量沒有積極影響, 但是明顯提高了蝦青素的積累量。

圖2 不同濃度MLT對雨生紅球藻蝦青素含量的影響Fig. 2 Effects of MLT on astaxanthin content of H. pluvialis during induction process

2.3 MLT對微藻細胞ROS的影響

活性氧檢測試劑盒中的探針DCFH-DA可以自由穿過細胞膜，進入細胞后被胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH，ROS氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，檢測細胞內(nèi)熒光強度得到細胞內(nèi)活性氧的水平。圖3 顯示，細胞暴露在高光照、缺氮脅迫條件時，胞內(nèi)的活性氧水平快速提高，第7天時，胞內(nèi)活性氧水平達到最高，隨后呈現(xiàn)出下降趨勢，在培養(yǎng)過程中，10 μmol/L MLT處理組和對照組呈現(xiàn)出相似的趨勢，但始終低于對照組，Shi等[7]在狗牙根(bermudagrass)中也有相似的結(jié)果。ROS抑制劑組活性氧一直處于很低的水平，同時對蝦青素含量進行測定，發(fā)現(xiàn)蝦青素含量很低（圖3）。結(jié)果表明，活性氧對雨生紅球藻蝦青素的合成至關(guān)重要，適量的ROS觸發(fā)蝦青素積累，過高時對微藻細胞產(chǎn)生毒害，過低時又不能有效的觸發(fā)蝦青素積累。

2.4 MLT誘導(dǎo)對細胞NO的影響

NO是一種不穩(wěn)定的氣態(tài)分子，在細胞內(nèi)很快代謝成硝酸鹽和亞硝酸鹽，通過檢測兩者的總量來計算NO的量。結(jié)果顯示外源MLT能顯著提高細胞內(nèi)NO含量（圖4），NO水平起初逐步下降，在第7天時, 10 μmol/L MLT處理組達到最高（73 μmol/L），是對照組的4.06倍，此時，MLT處理組蝦青素的含量也開始明顯高于對照組（圖4），抑制劑處理顯著抑制了NO濃度，蝦青素的最大積累量也顯著下降,達到9.36 mg/g，分別是對照組和10 μmol/L MLT處理的64.84 %和23.94 %。結(jié)果表明，NO在蝦青素生物合成中起到一定的調(diào)控作用，有助于蝦青素的積累。

2.5 MLT誘導(dǎo)對藻細胞內(nèi)SA含量的影響

SA是一種信號分子, 參與植物對脅迫條件的應(yīng)激反應(yīng), 能調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。10 μmol/L MLT處理的SA水平第1、第3天時顯著高于對照組,第7天時達到最高隨后下降, 對照組在第9天時達到最高, SA抑制組波動不大且含量較低（圖5）。由圖5 可知， SA抑制劑組蝦青素的含量很低。結(jié)果表明, MLT處理組能有效調(diào)節(jié)SA含量, 且促進了蝦青素的增長, SA被抑制時, 蝦青素含量大幅降低,可見, SA在雨生紅球藻蝦青素生物合成過程中起著重要作用。

2.6 MLT誘導(dǎo)對dxs基因表達量的影響

用qRT-PCR方法檢測不同誘導(dǎo)時間內(nèi), 10 μmol/L MLT誘導(dǎo)組和對照組間雨生紅球藻蝦青素相關(guān)合成基因dxs的表達量(圖6), 結(jié)合蝦青素含量變化趨勢, 10 μmol/L MLT處理組dxs基因表達量第7天時顯著高于對照組, 第9天時, 達到最高, 是對照組的11.7倍, 蝦青素的含量第7天開始明顯高于對照組,第13天時達到最高31.32 mg/g, 此時dxs基因的表達量是對照組的2.74倍。

3 討論

圖3 MLT和ROS抑制劑對雨生紅球藻內(nèi)ROS水平和蝦青素含量的影響Fig. 3 Effect of MLT and a ROS inhibitor on the ROS levels and astaxanthin content of H. pluvialis during induction process

圖4 MLT和NO抑制劑對細胞內(nèi)NO濃度和蝦青素含量的影響Fig. 4 Effects of MLT and NO inhibitor on the NO levels and astaxanthin content of H. pluvialis during induction process

圖5 MLT和SA抑制劑對細胞內(nèi)SA水平和蝦青素含量的影響Fig. 5 Effects of MLT and Salicylic acid (SA) inhibitor on the SA levels and astaxanthin content of H. pluvialis during induction process

本文探究了在高光照、氮缺陷的脅迫條件下,外源添加不同濃度MLT對雨生紅球藻蝦青素積累的影響及其可能的調(diào)控機制。在10 μmol/L MLT處理下, 藻細胞生物量較對照組無顯著性變化。這與Tal等[22]的研究結(jié)果相似, 添加MLT對萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻細胞的生長沒有明顯影響; Li等[19]研究表明外源添加褪黑素對單針藻生長也無顯著性影響。此外, 本研究中外源添加MLT可提高雨生紅球藻中蝦青素的含量, 在10 μmol/L MLT誘導(dǎo)條件下藻細胞中蝦青素的積累量可達31.32 mg/g, 與其他文章所述的雨生紅球藻中蝦青素含量相比優(yōu)勢較明顯[23,24]。添加100 mg/L的褪黑素處理葡萄(Vitis vinifera)幼果, 可引起葡萄果實內(nèi)源褪黑素積累, 促進果實膨大[25]。外源添加褪黑素可提高高溫脅迫下黃瓜幼苗抗壞血酸代謝活性[26], 增強ROS清除能力[27], 提高氮代謝能力[28], 促進高溫逆境下黃瓜幼苗的生長。另一方面, 在非生物脅迫條件下, MLT可通過多種機制調(diào)控植物脅迫應(yīng)答, 清除過剩ROS及調(diào)控信號分子備受關(guān)注[29]。

圖6 MLT對dxs基因表達量的影響Fig. 6 Effects of MLT on the transcriptional expression level of dxs during induction process

有研究表明ROS在細胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累中起著雙重作用, 一方面, 能破壞細胞的生物大分子, 另一方面, ROS產(chǎn)生能促進雨生紅球藻和杜氏藻中β-胡蘿卜素的積累[14,30,31]。在本研究中, 高光照和氮缺陷條件引起了細胞內(nèi)ROS的迸發(fā), MLT作為抗氧化劑緩解了ROS的急劇增加, 在一定程度上保護了細胞內(nèi)的生物大分子, 同時誘發(fā)了細胞內(nèi)蝦青素大量合成。此外, ROS的產(chǎn)生可能激活機體多種抗氧化系統(tǒng)進而調(diào)控ROS水平, 保持ROS產(chǎn)生與清除的平衡。在高等植物中, 抗性受多重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控, 其中SA和NO是重要的信號分子。Shi等[32]研究發(fā)現(xiàn), 外源添加MLT能提高擬南芥中NO和SA含量, 進而增加其抗性相關(guān)基因表達量, 表現(xiàn)為抗病性提高, 而雨生紅球藻正是通過大量積累蝦青素來應(yīng)對不利環(huán)境的[33,34]。在10 μmol/L MLT誘導(dǎo)雨生紅球藻時, 下調(diào)了ROS水平, 上調(diào)了NO、SA含量, 促進了蝦青素的積累。此外, Ková?ik等[35]發(fā)現(xiàn)向Coccomyxa subellipsoidea中添加抗氧化劑維生素C降低了ROS水平, 提高了NO的含量, 進而提高了藻細胞對非生物脅迫的耐受性。Gao等[36]外源添加SA促進了雨生紅球藻中蝦青素的積累?？梢? 褪黑素可能是通過調(diào)控藻細胞內(nèi)ROS、NO和SA的含量來促進蝦青素的積累的。為了驗證上述假設(shè), 本試驗在10 μmol/L MLT處理組的基礎(chǔ)上分別添加ROS、NO和SA抑制劑, 發(fā)現(xiàn)ROS、NO和SA水平受到明顯抑制, 蝦青素的積累量顯著降低?？梢娦盘柗肿覴OS、NO和SA均參與蝦青素的生物合成。

諸多報道顯示外源添加一些植物生長調(diào)節(jié)劑,蝦青素大量積累往往伴隨著相關(guān)生物合成基因表達水平的提高。添加赤霉素和茉莉酸甲酯可顯著提高dxs基因表達水平, 同時提高了蝦青素的產(chǎn)量[37,38],dxs酶基因是蝦青素生物合成途徑中第一個限速酶(1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶, DXS)調(diào)控基因, 對比dxs基因表達量與蝦青素積累量可知, 二者雖不具有同步性, 但dxs基因表達量增加后藻細胞蝦青素大量積累, 可能是由于MLT誘導(dǎo)提高了dxs基因的表達量, DXS活性增高, 從而促進了丙酮酸和甘油醛-3-磷酸(GA3P)向DOXP的轉(zhuǎn)化, 為后續(xù)蝦青素的大量合成提供了足夠的底物, 進而提高了蝦青素的積累量。

綜上所述, 在高光照聯(lián)合氮缺陷培養(yǎng)條件下,誘發(fā)了雨生紅球藻細胞中的ROS的迸發(fā), 添加MLT時能清除細胞內(nèi)過多的ROS, 保證了細胞的正常代謝活性; 另一方面, 褪黑素增加SA和NO的水平, 可能通過調(diào)控SA和NO依賴抗性途徑增強雨生紅球藻對脅迫條件的響應(yīng), 上調(diào)蝦青素生物合成酶基因dxs的表達, 進而促進蝦青素的合成。本研究表明, 添加適量濃度的MLT有利于雨生紅球藻中蝦青素的積累, 當(dāng)MLT濃度為10 μmol/L MLT時, 藻細胞中蝦青素可達31.32 mg/g; 此外, 本研究中MLT誘導(dǎo)雨生紅球藻中蝦青素的大量積累, 可能與其調(diào)控細胞內(nèi)ROS、SA、NO及dxs基因表達有關(guān), 后續(xù)分子生物學(xué)機制需進一步探究。