劉春勝 萬 逸 高 菲 陳四清 王愛民 顧志峰

(1. 海南大學(xué)南海海洋資源利用國家重點實驗室, ?？?570228; 2. 海南大學(xué)海洋學(xué)院, ?？?570228;3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所, 青島 266071)

刺胞動物為雙胚層、輻射對稱的簡單生物, 在分類學(xué)上其可分為僅具固著生活的珊瑚蟲綱(Anthozoa)和水螅綱(Hydrozoa), 以及具固著和浮游交替世代的缽水母綱(Scyphozoa)和立方水母綱(Cubozoa)[1,2]。在進化生物學(xué)上, 刺胞動物是最原始的真后生動物, 其被認為是其他高等多細胞動物的起點, 具有極其重要的地位[3]。因此, 解析該類群的發(fā)展演變過程對闡明兩側(cè)對稱動物多樣化進化模式, 重構(gòu)生命演化歷程具有重要意義。而研究其早期胚胎發(fā)育和變態(tài)過程是解析當前刺胞動物演化模式的主要方法之一[2,4,5]。

截至目前, 水螅綱和珊瑚蟲綱中多個物種的發(fā)育模式已初步建立并不斷完善, 如淡水水螅(Hydra)、有種貝螅(Hydractinia echinata)、?？?Nematostella vectensis)、珊瑚(Acropora millepora)等[6—9]。與之相比, 缽水母綱和立方水母綱物種的發(fā)育模式研究報道較少[10,11]。現(xiàn)有證據(jù)表明, 在胚胎發(fā)育細胞軸向構(gòu)建過程中, 固著生活的珊瑚類和水螅類物種的某些同源基因表達模式存在顯著的差異[12—14], 并據(jù)此推斷該現(xiàn)象是由于6億多年前不同刺胞動物物種進化差異所造成的[15]。

海蜇(Rhopilema esculenta)隸屬于缽水母綱(Scyphozoa)根口水母目(Rhizostomeae)根口水母科(Rhizostomidae)海蜇屬(Rhopilema), 分布于中國、日本、朝鮮沿岸以及蘇聯(lián)遠東水域, 是一種經(jīng)濟價值極高的大型可食用水母, 它也是我國研究最為深入的缽水母種類[16]。作為世界上唯一的人工養(yǎng)殖類可食用水母, 海蜇在我國的海洋漁業(yè)中占有重要地位, 年產(chǎn)值近百億[17]。我國對海蜇研究也多是將其作為漁業(yè)資源來開展, 相關(guān)成果主要集中在苗種繁育、池塘養(yǎng)殖、資源調(diào)查以及增殖放流等領(lǐng)域[17—21], 而對其早期胚胎發(fā)育研究涉及較少, 且多僅局限于簡單的形態(tài)描述[16,22,23]?；诖? 本研究擬通過掃描電鏡、透射電鏡和蛋白銀染色等多種組織學(xué)方法對海蜇胚胎發(fā)育和變態(tài)過程進行觀察,旨在系統(tǒng)研究其早期發(fā)育特點。

1 材料與方法

1.1 材料獲取

實驗于2015年8月20—28日在山東省海洋捕撈生產(chǎn)管理站開展海蜇有性繁殖實驗, 待海蜇產(chǎn)卵后(產(chǎn)卵時間為00:30)用400目篩絹收集足量的受精卵轉(zhuǎn)移至500 L白色塑料桶中, 微充氣孵化, 孵化水溫(26±1)℃, 鹽度26—27、光照強度400—500 lx。用Olympus AX顯微鏡定期觀察胚胎發(fā)育過程, 待受精卵發(fā)育至不同時期后, 用400目篩絹收集一定量個體轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中, 然后用2.5%戊二醛(0.2 mol/L PBS配制, 4℃)清洗3遍, 最終固定于相同濃度的戊二醛溶液中。附著后的海蜇杯狀體和4觸手螅狀體2個發(fā)育階段, 則需在Olympus SZX體視鏡下用解剖刀小心將其從聚乙烯波紋板表面刮下,而后用2.5%戊二醛清洗并固定。胚胎發(fā)育不同階段取樣時間參照劉春勝等[16], 具體如下: 受精卵為排卵后10—15min; 2細胞期為排卵后25—30min,64細胞期為排卵后約3h, 原腸胚為排卵后約5h, 早期浮浪游蟲為排卵后15h, 后期為排卵后48h, 杯狀體為排卵后50h, 4觸手螅狀體為排卵后72h。

1.2 掃描電鏡樣品制備與觀察

取一定量的固定樣品轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,用PBS磷酸緩沖液清洗, 乙醇梯度脫水后(30%、50%、70%、85%、90%各 1 次, 每次10min,100%乙醇2次, 每次15min), 進行乙酸異戊酯置換,而后進行二氧化碳臨界干燥處理(XD-1 型, 美國Eiko公司)和噴金鍍膜(IB-3型, Eiko公司, 美國), 最后進行掃描電鏡(JSM-840, JEOL公司, 日本)觀察。

1.3 透射電鏡樣品制備與觀察

取適量固定樣品, 用PBS清洗后, 1%鋨酸4℃固定4h, PBS 緩沖液沖洗后, 乙醇梯度脫水, Epon812環(huán)氧樹脂包埋。樣品包埋完成后用Ultracut E超薄切片機(Ultracut EUItramicrotome, Reichert-Jung 公司, 德國)半薄切片, 厚度1 μm, 甲苯胺藍染色, 而后置于Olympus AX顯微鏡下觀察。定位后再修塊并進行超薄切片, 厚70 nm, 醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色,透射電鏡(JEM-1200EX, JEOL公司, 美國)觀察。

1.4 蛋白銀染色制片與觀察

海蜇不同發(fā)育階段制片方法采用Wilbert的蛋白銀染色法[24]。將制備樣片置于Olympus AX顯微鏡下觀察, 拍照。

2 結(jié)果

2.1 海蜇早期發(fā)育掃描電鏡觀察

海蜇受精卵直徑約為90—120 μm, 其從分裂開始至原腸胚階段, 細胞分裂方式為均等分裂(圖1d)。對64細胞進一步觀察發(fā)現(xiàn), 其細胞與細胞之間存在非常多的胞間連接(圖2a)。進入原腸期后, 胚胎出現(xiàn)內(nèi)陷(圖1d), 而后細胞逐漸拉伸變?yōu)闄E圓形。進入浮游的浮浪游蟲階段(圖1e), 浮游幼蟲繼續(xù)伸長,在附著變態(tài)前其長軸達到210 μm (圖1f)。當遇到適宜附著基后, 浮浪幼蟲后端細胞經(jīng)一系列變化,分化成具黏附能力的柱狀細胞附著于附著基表面(圖1g)。約50h后, 變態(tài)浮浪游蟲從基部的附著部位開始拉伸, 頂部膨大, 形成高腳酒杯狀的杯狀體(圖1h)。對即將變態(tài)的浮浪幼蟲附著部位(圖2b、2c)觀察發(fā)現(xiàn), 其與附著基黏附的細胞多呈不規(guī)則柱狀,且具小囊泡狀結(jié)構(gòu)。而杯狀體附著部位則發(fā)育為盤狀(圖2d)。

圖1 海蜇胚胎發(fā)育和變態(tài)Fig. 1 Embryonic development and metamorphosis of R. esculentum

圖2 細胞連接及附著部位顯微結(jié)構(gòu)Fig. 2 Ultrastructure of cell junction and attachment site

2.2 海蜇早期發(fā)育透射電鏡觀察

透射電鏡結(jié)果表明, 原腸期細胞未出現(xiàn)分化,呈長扇形(長軸長約17 μm), 細胞核位于外部1/3處,顏色較深的卵黃體位于內(nèi)部1/2處(圖3a)。細胞朝向外部位置線粒體較多(圖3b), 表明細胞代謝活躍。進入浮浪幼蟲期后, 內(nèi)部空腔消失, 呈現(xiàn)實體化(圖3c)。細胞進一步分裂, 并出現(xiàn)細胞分化, 外胚層近中膠層細胞分化出現(xiàn)刺細胞, 最外層細胞出現(xiàn)空泡化, 且部分外部細胞內(nèi)部卵黃體逐步分解為卵黃顆粒, 細胞間具緊密連接(圖3c、3d、3e)。海蜇浮浪幼蟲發(fā)育過程中, 盡管細胞長軸變長, 但其內(nèi)部細胞與早期相比無顯著差異(圖3f、3g、3h)。

海蜇浮浪游蟲附著變態(tài)后, 其外層細胞間布滿緊密連接, 使整個外部細胞黏連在一起, 幾乎所有外部細胞內(nèi)部具有空泡, 且空泡化體積更大(圖4a、4c)。此外, 外胚層細胞內(nèi)部出現(xiàn)疑似凋亡小體結(jié)構(gòu)(圖4c),內(nèi)胚層細胞內(nèi)出現(xiàn)大量核糖體(圖4d)。72h 4觸手螅狀體以中膠層為界限, 所有外層細胞均出現(xiàn)極高的空泡化, 內(nèi)胚層細胞僅出現(xiàn)少量的空泡化, 且仍富含有顏色較深的卵黃體(圖4e、4f)。該階段在螅狀體表面觀察到成熟的刺細胞(圖4g), 并發(fā)現(xiàn)到大量疑似凋亡小體的結(jié)構(gòu)(圖4h)。

2.3 纖毛的形成與退化過程觀察

通過海蜇早期不同發(fā)育階段蛋白銀染色制片觀察發(fā)現(xiàn), 其在早期和晚期浮浪游蟲階段, 以及杯狀體階段具有纖毛(圖5), 而原腸胚和4觸手螅狀體階段未發(fā)現(xiàn)纖毛結(jié)構(gòu)。

2.4 胚胎發(fā)育各階段對細菌的吞噬作用

通過對原腸期、浮浪游蟲期和即將變態(tài)的浮浪游蟲三個發(fā)育階段的掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn), 僅浮浪游蟲階段表面附著有細菌(1.4—2 μm)(圖6c、6d),其他時期細胞表面僅有大量＜400 nm非生物體狀囊泡(原腸期, 圖6a、6b; 浮浪幼蟲變態(tài)期, 圖6g、6h)。透射電鏡結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)在浮浪游蟲階段, 海蜇能夠吞噬細菌, 進行胞內(nèi)消化(圖6e、6f)。

圖3 原腸期和浮浪游蟲期透射電鏡觀察Fig. 3 Representative images of gastrula and planula with transmission electron microscopy (TEM)

圖4 杯狀體期和4觸手螅狀體期透射電鏡觀察Fig. 4 Representative images of scyphostoma and 4-tentacle polyp with TEM

3 討論

3.1 海蜇早期發(fā)育過程中的細胞學(xué)特征

刺胞動物為低等雙胚層生物, 其生物體由外胚層、內(nèi)胚層以及兩者間的中膠層組成。通過對其整個早期發(fā)育階段研究發(fā)現(xiàn), 海蜇在原腸期之前細胞為均等分裂, 且未出現(xiàn)顯著的細胞分化現(xiàn)象。而同為缽水母的海月水母其早期多細胞階段即出現(xiàn)了不均等分裂[25]。?？?Nematostella vectensis)則在4細胞階段即出現(xiàn)不均等分裂[26]。由此可以初步推測海蜇的細胞分化時期與其他刺胞動物相比要延后。

圖5 浮浪游蟲和杯狀體期纖毛顯微觀察Fig. 5 Representative images of cilium at planula and scyphostoma stage

在細胞分化發(fā)育過程中, 海蜇在早期浮浪游蟲的外胚層細胞中觀察到空泡, 且隨著其發(fā)育空泡比例逐漸升高, 在72h的4觸手螅狀體時期幾乎所有的外胚層細胞均出現(xiàn)高度的空泡化, 而內(nèi)胚層細胞在其附著后才出現(xiàn)少量的空泡化。盡管該現(xiàn)象在海月水母中已有報道, 但其空泡化僅出現(xiàn)在內(nèi)胚層[11]。進一步研究發(fā)現(xiàn), 在空泡化現(xiàn)象較為普遍的杯狀體和4觸手螅狀體時期, 觀察到大量疑似凋亡小體的囊泡, 推測這2種現(xiàn)象是同步進行的, 且與海蜇細胞分化和重排有密切關(guān)系。

與其他高等動物相比, 刺胞動物細胞類型較為單一, 本實驗在海蜇早期發(fā)育階段共鑒定3種外胚層細胞(纖毛運動細胞、刺細胞和普通體細胞), 未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)及感應(yīng)相關(guān)細胞。而在同屬缽水母綱的朝天水母(Cassiopeia xamachana)中鑒定了4種[27]。與之相比, 水螅綱和珊瑚蟲綱早期幼蟲中細胞種類較多, 包括上皮肌肉細胞, 腺細胞、感覺前體細胞、神經(jīng)細胞和刺細胞共5種[28,29], 而立方水母綱較少僅2種[30]。相關(guān)報道已證實了海蜇浮浪游蟲具有趨弱光性和應(yīng)激反應(yīng)能力[16], 但在本研究未發(fā)現(xiàn)相關(guān)類型細胞, 或許與所用的方法有關(guān)。在已報道的刺胞動物早期發(fā)育相關(guān)研究中, 表明神經(jīng)和感應(yīng)細胞數(shù)量相對較少, 透射電鏡觀察結(jié)果具隨機性,難以對特定細胞準確定位和鑒定。與之相比, FMRFamide 熒光免疫反應(yīng)靶向性較強, Yuan等[11]利用該方法確定了海月水母浮浪游蟲中神經(jīng)細胞僅存在于口周邊的外胚層。此外, 本實驗在對刺細胞觀察中, 發(fā)現(xiàn)海蜇的刺細胞最早形成于早期浮浪游蟲外胚層近中膠層位置, 其后逐漸成熟, 位置亦逐步外移, 當發(fā)育至4觸手階段才觀察到成熟刺胞囊, 由此推斷, 4觸手螅狀體之前各階段海蜇是不能主動捕食的。該結(jié)果與劉春勝[16]等關(guān)于海蜇早期攝食研究結(jié)果一致。

圖6 不同發(fā)育胚胎階段細胞內(nèi)吞Fig. 6 Endocytosis of different developmental stage

3.2 浮浪游蟲纖毛的形成與退化

所有刺胞動物早期發(fā)育過程均需經(jīng)歷由靜止到浮游, 再到附著變態(tài)的過程, 而纖毛是浮浪游蟲趨利避害的主要運動器官。盡管大量研究對纖毛的結(jié)構(gòu)和功能進行了描述, 但截至目前尚未有纖毛形成與退化相關(guān)報道[11,26,30—32]。本研究利用透射和掃描電鏡, 以及蛋白銀染色方法首次對各階段纖毛變化進行了系統(tǒng)研究, 發(fā)現(xiàn)海蜇纖毛形成于早期浮浪游蟲階段, 其附著后逐漸退化, 在4觸手螅狀體階段才完全消失, 其存在時間幾乎與浮游時間完全吻合。

3.3 海蜇早期發(fā)育營養(yǎng)來源

浮游幼蟲是刺胞動物、貝類、魚類等多數(shù)海洋生物早期發(fā)育的必經(jīng)階段, 其營養(yǎng)來源主要由攝食浮游餌料和內(nèi)源營養(yǎng)2種類型組成[33,34]。對包括刺胞動物在內(nèi)的大部分物種而言, 早期浮游生物為內(nèi)源性營養(yǎng)型, 即卵黃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)[28,29,35]。在海蜇早期發(fā)育各個時期, 其內(nèi)部亦發(fā)現(xiàn)大量的富含顏色較深的卵黃體, 如原腸期卵黃體分布于細胞靠內(nèi)1/2處, 浮浪幼蟲、杯狀體和4觸手螅狀體的外胚層近中膠層細胞和內(nèi)胚層細胞中亦觀察到大量富含卵黃顆粒的細胞。由此推斷, 內(nèi)部卵黃營養(yǎng)是海蜇早期發(fā)育的營養(yǎng)來源之一[16]。然而本實驗在浮浪游蟲階段首次觀察到海蜇外層細胞能夠主動吞噬細菌, 且該現(xiàn)象未在后期的杯狀體和4觸手螅狀體階段中發(fā)現(xiàn), 由此我們推斷海蜇在較為活躍的浮浪幼蟲階段能夠通過胞吞作用攝食細菌。盡管大量報道證實了細菌在刺胞動物附著變態(tài)過程中具有相關(guān)性, 并證實菌膜能夠產(chǎn)生刺激刺胞動物浮浪游蟲附著變態(tài)[36—38]。但尚未有刺胞動物早期攝食細菌的報道, 本實驗首次觀察到了刺胞動物浮浪幼蟲攝食細菌現(xiàn)象, 具有重要意義。