劉棋琴 羊 芃 馬明婕 周麗亞 李亞鶴 楊 銳,

(1. 寧波大學海洋學院, 寧波 315211; 2. 寧波大學浙江省海洋生物工程重點實驗室, 寧波 315211)

近年來, 海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛, 沿海養(yǎng)殖場中池塘養(yǎng)殖的廢水排放量與日俱增, 導致近岸海水的富營養(yǎng)化日益嚴重[1], 其主要污染指標為無機氮和活性磷酸鹽[2]。水體惡化導致更多災難性環(huán)境事件發(fā)生[3], 嚴重影響了海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及海洋生態(tài)安全[4]。富營養(yǎng)化水體的治理已成為當今世界性難題[5]。國內(nèi)外學者一致認為, 大型海藻具有極佳的水體凈化能力, 并具有較高經(jīng)濟價值, 是進行養(yǎng)殖污水處理和富營養(yǎng)化水體修復的有效方式[6—9]。20世紀70年代大型海藻作為生物濾器凈化水體開始發(fā)展, 后來被很多專家學者所重視, 逐漸發(fā)展并完善了大型海藻與魚、蝦、貝等混養(yǎng)的綜合生態(tài)養(yǎng)殖模式, 篩選合適的藻類和凈水處理工藝是利用大型海藻進行污染水體的生物修復亟待解決的問題[10]。

海洋藻類是海洋初級生產(chǎn)力的重要組成, 可利用CO2和氮、磷等營養(yǎng)素進行光合作用。近海大型海藻的大規(guī)模養(yǎng)殖可以消耗生活海區(qū)大量C、N、P等元素, 改變了海區(qū)的物質(zhì)循環(huán); 有的甚至可以起到了控制赤潮延緩海域富營養(yǎng)化的作用。至今為止, 關(guān)于大型海藻用于水體營養(yǎng)鹽吸收的研究有很多[11—15], 同時, 對不同營養(yǎng)鹽的吸收速率受環(huán)境因素如溫度、光照強度的影響, 并表現(xiàn)出一定的種間差異[13,14,16,17], 其次, 即使是同一藻種, 對氨氮、硝氮等不同營養(yǎng)鹽的吸收對環(huán)境因素的響應也不同,如石莼、鐵釘菜、蜈蚣藻對-N[18]的吸收速率在低溫5℃時最高, 但對-N的吸收則在15℃時最高[18]?？紤]到水產(chǎn)養(yǎng)殖及運用大型海藻進行廢水處理的季節(jié)性, 這其中溫度是主要的影響因素,結(jié)合浙江當?shù)匮睾ｐB(yǎng)殖廢水的實際狀況, 本實驗以常見大型經(jīng)濟海藻裂片石莼(Ulva fasciata)、腸滸苔(Ulva intestinalis)、龍須菜(Gracilaria lemaneaformis)、壇紫菜(Pyropia haitanensis)為材料, 通過評估不同溫度下它們的N、P吸收效率、生長及光合生理特性等, 獲得不同溫度下N、P去除效率高、生理指標相對較優(yōu)的藻種, 優(yōu)化養(yǎng)殖廢水處理模式, 為實地實踐提供備選藻類和處理方案。

1 材料與方法

1.1 材料

裂片石莼、腸滸苔、龍須菜、壇紫菜于2016年采于溫州市平陽縣鰲江鎮(zhèn)附近海域(120°20′E,27°35′N)。挑選鮮活健康的藻體, 用消毒海水清洗,軟毛刷除凈表面附著物, 并用0.7%的KI溶液浸泡10min, 除去雜藻和細菌, 然后用滅菌海水沖洗兩次備用。實驗開始前, 每種藻取3 g至1000 mL燒杯中在光照培養(yǎng)箱中充氣預培養(yǎng)1d(培養(yǎng)光強100 μmol/(m2·s),光周期為12h L∶12h D), 溫度與實驗溫度一致。預培養(yǎng)海水為人工配制[19], 鹽度為30。

1.2 實驗方法

將裂片石莼、龍須菜、腸滸苔、壇紫菜放置在富營養(yǎng)化水體中, 分別在15、 20、 25、 30℃條件下光照培養(yǎng)48h。培養(yǎng)過程中于0、6、12、24、36、48h進行水質(zhì)檢測, 培養(yǎng)結(jié)束后測定海藻生長速率及葉綠素熒光參數(shù)。

培養(yǎng)條件溫度梯度設(shè)置15、 20、 25、 30℃,在人工海水中依次加入NaNO2、NaNO3、NH4Cl、NaH2PO4藥品, 培養(yǎng)基中N、P終濃度為C(-N)=10.87 μmol/L, C(-N)=70.97 μmol/L, C(-N)=100 μmol/L, C(-P)=8.46 μmol/L。培養(yǎng)時, 取(1±0.005) g的藻體(濕重)置于1 L 的燒杯中, 初始培養(yǎng)液體積為832 mL, 培養(yǎng)條件同預培養(yǎng)條件。

水樣指標測定培養(yǎng)后0、6、12、24、36、48h進行水質(zhì)取樣, 測定培養(yǎng)基中的N、P含量。對-N的分析采用萘乙二胺分光光度法, 對-N分析采用次溴酸鹽氧化法, 對-P的分析采用磷鉬藍分光光度法, 對-N分析采用鋅鎘還原法。檢測方法參照GB/T 12763.4-2007《海洋調(diào)查規(guī)范第四部分: 海洋化學要素調(diào)查》中的相關(guān)標準進行。

生長速率的測定培養(yǎng)前和培養(yǎng)后進行藻體鮮重的測定。用吸水紙吸干藻體表面的水分, 使用電子天平稱量藻體鮮重。相對生長速率計算公式為(RGR, %/d)= 100×(LnWn–LnWn–1)/(tn–tn–1),Wn–1、Wn分別為為tn–1、tn時的藻體鮮重。

葉綠素熒光參數(shù)的測定在每個條件下培養(yǎng)48h后, 采用葉綠素調(diào)制熒光儀(water PAM)進行熒光參數(shù)的測定。具體操作如下: 不同處理的樣品在黑暗條件下處理15min, 在培養(yǎng)光強條件下(光化光接近培養(yǎng)光強)進行葉綠素熒光誘導曲線的測定,獲得最大(Fv/Fm)及培養(yǎng)光強下的有效光化學效率(Fv′/Fm′)。設(shè)置8個光強梯度[114、167、257、379、570、861、1218及1692 μmol/(m2·s)]進行快速光響應曲線(RLC)的測定, 每個光強梯度持續(xù)時間為10s, 飽和脈沖為5000 μmol·photons/(m2·s)。相對電子傳遞速率(rETR)通過以下的公式計算:其中a、b、c為擬合參數(shù), 并以此計算出光能利用效率α、最大電子傳遞速率rETRmax和飽和光強Ek, 計算公式如下[20]:

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 7.0和SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析, 用t檢驗法(t-tests)方差分析檢測平均數(shù)之間的差異(P), 以P＜0.05作為差異的顯著性水平。

圖1 不同溫度下4種藻類的生長情況Fig. 1 RGR of 4 macroalgae species of different temperatures

2 結(jié)果

2.1 藻類生長

在15—25℃內(nèi), 溫度變化對裂片石莼生長無顯著影響(P＞0.05)。龍須菜、壇紫菜和腸滸苔的生長在不同溫度下差異顯著(P＜0.05), 最高相對生長率均出現(xiàn)在20℃與25℃, 溫度為15℃和30℃時相對生長率明顯降低, 壇紫菜在30℃時甚至出現(xiàn)負增長,說明高溫對壇紫菜的正常生長造成威脅。4種藻中腸滸苔生長得最快, 20℃時每天的相對生長率高達24%, 20℃與25℃時生長情況明顯優(yōu)于其他3種藻類。

2.2 營養(yǎng)鹽吸收情況

對比分析(圖2)顯示: 在15—30℃內(nèi), 腸滸苔和裂片石莼對-N的吸收能力明顯優(yōu)于龍須菜和壇紫菜, 綠藻培養(yǎng)基中的-N在12h內(nèi)均基本被吸收完畢, 且腸滸苔對-N吸收能力略優(yōu)于裂片石莼(P＞0.05)。而在不同溫度下龍須菜與腸滸苔水體中-N在48h內(nèi)也基本被藻體吸收, 說明4種海藻-N的吸收能力均較佳。15℃時龍須菜對-N的吸收速率明顯降低, 說明低溫對其-N吸收效果造成明顯限制。

圖2 不同溫度處理下氨氮濃度隨時間變化曲線Fig. 2 The changes of -N concentration in culture medium under different temperatures

圖3 不同溫度處理下活性磷濃度隨時間變化曲線Fig. 3 The changes of -P concentration in culture medium under different temperatures

圖4 不同溫度處理下硝氮濃度隨時間變化曲線Fig. 4 The changes of -N concentration in culture medium under different temperatures

圖5 不同溫度處理下亞硝氮濃度隨時間變化曲線Fig. 5 The changes of -N concentration in culture medium under different temperatures

本研究發(fā)現(xiàn), 4種藻類對水體中的營養(yǎng)鹽吸收均十分顯著, 按照營養(yǎng)鹽吸收能力高低排序為: 腸滸苔＞裂片石莼＞壇紫菜＞龍須菜; 裂片石莼和腸滸苔在不同溫度下對水體中各營養(yǎng)鹽吸收效果較好,具有去除N、P能力強、適溫范圍廣的特點; 其中腸滸苔對-N、-N、-P的吸收能力均為最佳; 在15℃和20℃環(huán)境下, 壇紫菜對-N的吸收能力十分顯著, 但其營養(yǎng)鹽吸收受高溫限制;龍須菜對-N吸收能力強, 對其他營養(yǎng)鹽吸收能力相對較弱, 且低溫會對其吸收效果造成明顯限制。

2.3 熒光參數(shù)

隨著溫度升高,ETRmax與Ik均呈先上升后下降的趨勢, 25℃時, 裂片石莼、龍須菜、壇紫菜與腸滸苔的rETRmax顯著增高, 在15℃和30℃時數(shù)值相對較低; 溫度對其表觀光能利用效率的影響不顯著(P＞0.05)(表1)。溫度對裂片石莼和腸滸苔的最大(Fv/Fm)及有效光化學效率(Fv′/Fm′)無明顯影響, 說明這2種藻溫度耐受范圍較廣。在15℃培養(yǎng)時, 龍須菜的Fv/Fm及Fv′/Fm′均降低; 而30℃時不影響龍須菜Fv/Fm, 但明顯抑制了Fv′/Fm′。壇紫菜在25℃時Fv/Fm和Fv′/Fm′顯著增高, 至30℃時Fv/Fm和Fv′/Fm′均迅速下降(圖6), 說明30℃對壇紫菜的PSII系統(tǒng)造成傷害?？傮w來講, 腸滸苔與裂片石莼rETRmax與Ik數(shù)值較高, 與Fv/Fm與Fv′/Fm′數(shù)值表現(xiàn)一致。

表1 不同溫度下4種大型海藻的相對電子傳遞速率與光強關(guān)系的最佳擬合參數(shù)Tab. 1 The best fitting parameters derived from relative electron transport rate (rETR) v.s. irradiance curve of four macroalgae species under different temperatures

圖6 不同溫度處理下最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm, A)及有效光化學量子產(chǎn)量(Fv′/Fm′, B) (P＜0.5)Fig. 6 Effects of different temperatures on Fv/Fm and Fv′/Fm′

3 討論

3.1 溫度對大型海藻營養(yǎng)鹽吸收的影響

藻類對營養(yǎng)鹽的吸收受溫度的影響, 溫度是控制大型海藻氮吸收的重要因子, 溫度對呼吸作用及光合作用暗反應的酶活性有顯著的影響[21]。大型海藻對營養(yǎng)鹽的吸收效果在一定的溫度范圍內(nèi), 過高或過低均不利于其對營養(yǎng)鹽的吸收, 這主要是由于在低溫條件下, 藻體參與光合作用暗反應的酶活性較低, 產(chǎn)生的用來還原硝氮鹽的底物也較缺乏,導致營養(yǎng)鹽的吸收速率降低, 而在高溫條件下, 藻體的呼吸作用顯著增加, 用于生長的能量也相對較少, 降低藻體的生長, 進而減少對營養(yǎng)鹽的吸收[22,23]。有研究表明, 大型海藻對營養(yǎng)鹽吸收可分為起始的短期快速吸收, 內(nèi)部營養(yǎng)鹽控制的穩(wěn)定吸收和外界營養(yǎng)鹽控制吸收在內(nèi)的3個階段[24,25], 這一發(fā)現(xiàn)解釋了本實驗-N與-P濃度變化曲線中, 開始6h內(nèi)培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽濃度迅速下降其后逐漸趨于平緩的現(xiàn)象(圖2、圖3)。-N和-N被認為是大型海藻生長最重要的氮源, 但一般認為前者更容易吸收, 在-N 將近耗盡之后, 藻體開始利用-N[26], 因此在本實驗中-N的濃度變化在初始階段減少的趨勢相對較緩。-N在4種藻類培養(yǎng)基中分解速度最慢, 這是由于-N為-N與-N的氧化中間態(tài), 轉(zhuǎn)換過程受水體中微生物活動影響, 是不穩(wěn)定的形態(tài), 因此-N在水體中存在時間較長[27]。

3.2 溫度對藻類生長及光合作用的影響

溫度是影響藻類生長發(fā)育, 也是影響植物生理成分的重要因素[28], 研究在不同溫度條件下葉綠素熒光的特性, 能夠指示出藻類光合系統(tǒng)的溫度適宜和抑制范圍[29]。在本研究中, 裂片石莼具有較高的適溫能力, 壇紫菜對高溫的耐受性相對較弱。腸滸苔的生長速率在4種藻類中最高, 且在不同溫度下均維持較好的生長狀況(圖1), 已有的研究發(fā)現(xiàn), 在我國由滸苔(Ulva prolifera)引發(fā)的綠潮事件中, 往往混有腸滸苔, 腸滸苔作為綠潮物種之一, 在5—30℃內(nèi)都可以存活, 具有旺盛的生長力[30,31]。因此利用腸滸苔進行養(yǎng)殖污水處理時應注意水域封閉性, 避免造成生態(tài)污染。

龍須菜、壇紫菜、腸滸苔在20℃與25℃時生長較快, 15℃與30℃生長受抑制。這可能是由于在適宜溫度范圍內(nèi), 一定程度的氣溫升高能夠加快藻類的代謝, 促進藻類的生長, 一旦超過這個范圍, 就會引起藻體同化和異化作用減弱、水分和營養(yǎng)吸收減慢、酶活性降低, 藻類光合作用受到抑制, 進而阻礙了藻類的正常生長[32,33]。

高溫30℃對龍須菜Fv/Fm影響不顯著, 但顯著降低其Fv′/Fm′, 且該溫度下其生長速率也明顯下降(表1、圖6), 這可能是在30℃條件下, 溫度脅迫阻礙PSII的電子傳遞, 使光合作用器官受氧化的風險增強, 這種氧化作用導致PSII系統(tǒng)的慢性損傷, 導致葉綠素熒光參數(shù)改變, 但并未使PSII系統(tǒng)完全失活[35]。盡管龍須菜是抗高溫品種, 但在30℃條件下其部分生理指數(shù)有顯著降低, 證明該溫度對龍須菜已經(jīng)造成一定脅迫。

3.3 利用藻類進行污水處理的方案

本實驗結(jié)果提示: 腸滸苔和裂片石莼適應溫度范圍大, N、P吸收能力強, 是利用大藻凈化污水實地應用的良好選擇。尤其腸滸苔對-N的吸收能力顯著, 處理高-N水體時可優(yōu)先考慮。由于不同藻類吸收營養(yǎng)鹽的特性不同, 在利用大型海藻凈化養(yǎng)殖廢水時, 要“因地制宜”, 根據(jù)實際情況選擇適宜凈水材料及方案。例如, 對蝦工廠化養(yǎng)殖廢水中-N高達TN的60%—70%, 養(yǎng)殖溫度為23℃至27℃之間[35], 因此, 選擇腸滸苔與裂片石莼, 利用其耐受高溫,-N吸收能力強的特點進行廢水處理會提高效率; 而因為壇紫菜不耐受高溫, 龍須菜-N吸收能力差, 所以二者不在考慮范圍內(nèi)。在蘇州地區(qū)南美白對蝦、塘羅氏沼蝦、河蟹池塘養(yǎng)殖中, 養(yǎng)殖水中-N濃度較高[36], 腸滸苔對-N的吸收能力最佳, 可優(yōu)先考慮。2012—2013年調(diào)查發(fā)現(xiàn), 流沙灣海水養(yǎng)殖區(qū)溶解無機磷(DIP)濃度較低(普遍小于0.05 mg/L), 而溶解無機氮(DIN)濃度則普遍較高, 尤其是春季(0.692—3.067 mg/L)和夏季(0.521—0.979 mg/L), 水體屬于明顯的P 限制,該地區(qū)常年養(yǎng)殖海域均處于嚴重的富營養(yǎng)化狀態(tài),且春夏季的有機污染嚴重[37]。基于當?shù)貭I養(yǎng)鹽成分特點, 可采用耐受高溫且P吸收能力較差的龍須菜進行海區(qū)修復。

值得注意的是, 裂片石莼與腸滸苔在36h內(nèi)已達到凈水目的, 龍須菜和壇紫菜在48h內(nèi)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽濃度也達到極低水平, 這說明在實際應用中應考慮到換水周期(一般情況下36—48h即可更換水體)或采用流通循環(huán)式的培養(yǎng)模式, 以達到既能去除N、P等營養(yǎng)鹽, 又能促進大型海藻的生長并避免因藻體腐爛造成的二次污染的目的。當然,不同藻類凈水效果不同, 因此可根據(jù)實際情況調(diào)整凈水工藝。另外, 溫度脅迫將造成大型海藻生長效率與同化作用減弱, 影響凈水效果, 并且大型海藻具有一定的生長季節(jié), 在夏秋季節(jié)利用大型海藻進行養(yǎng)殖污水處理將存在一定的局限性。發(fā)掘抗高溫藻類, 利用多種海藻輪作, 深入研究大型藻類與魚、蝦、貝類等互利機制是利用大型海藻進行海水修復的重要趨勢。