王明

[摘要] 目的 探討DNA甲基化檢測(cè)及其在急性髓系白血?。ˋML）和骨髓增生異常綜合征（MDS）中的臨床應(yīng)用。方法 選取2016年5月～2017年5月我院收治的急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者40例為研究組，選取同期健康體檢人員40例為對(duì)照組，比較兩組研究對(duì)象DNA甲基化檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果 研究組患者PAX6甲基化表達(dá)明顯高于對(duì)照組健康人群（P<0.05），同時(shí)高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05）；研究組患者GNDF甲基化表達(dá)明顯高于對(duì)照組健康人群（P<0.05），同時(shí)高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05）；研究組患者TJP1甲基化表達(dá)明顯高于對(duì)照組健康人群（P<0.05），同時(shí)高危患者甲基化水平明顯高于低?；颊撸≒<0.05）。結(jié)論 急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者的PAX6、GNDF、TJP1表達(dá)均呈現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)，且表達(dá)水平與患者病情存在正相關(guān)，可以作為臨床診斷及判斷患者預(yù)后的依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] DNA甲基化；急性髓系白血??；骨髓增生異常綜合征；表達(dá)； 血液系統(tǒng)疾病

[中圖分類號(hào)] R733.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）12-0001-04

Analysis on DNA methylation detection and its clinical application in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome

WANG Ming

Department of Hematology， Yuyao People's Hospital in Zhejiang Province， Yuyao 315400， China

[Abstract] Objective To investigate DNA methylation detection and its clinical application in acute myeloid leukemia （AML） and myelodysplastic syndrome （MDS）. Methods 40 cases of patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome who were admitted to our hospital from May 2016 to May 2017 were selected. 40 subjects receiving health examination during the same period of time were selected as the control group. The DNA methylation test results were compared between the two groups. Results The methylation expression of PAX6 in the study group was significantly higher than that in control group （P<0.05）. At the same time， the methylation level in high risk patients was significantly higher than that in low risk patients（P<0.05）； the methylation expression of GNDF in the study group was significantly higher than that in control group（P<0.05）. At the same time， the methylation level in high risk patients was significantly higher than that in low risk patients（P<0.05）； the methylation expression of TJP1 in the study group was significantly higher than that in control group（P<0.05）. At the same time， the methylation level in high risk patients was significantly higher than that in low risk patients（P<0.05）. Conclusion The expressions of PAX6， GNDF and TJP1 in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes are hypermethylated， and the expression level is positively correlated with the patient's condition， which can serve as a basis for clinical diagnosis and determination of prognosis.

[Key words] DNA methylation； Acute myeloid leukemia； Myelodysplastic syndrome； Expression； Hematological diseases

急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征屬于惡性的血液克隆疾病，其病因?yàn)樵煅杉?xì)胞失去正常分化能力及增殖調(diào)節(jié)。若治療不及時(shí)，患者常出現(xiàn)致命感染或器官浸潤(rùn)。AML以及MDS的具體作用機(jī)制仍不夠明確，不同毒素代謝以及DNA修復(fù)是研究的重點(diǎn)。同時(shí)體外研究結(jié)果表明，基因突變?cè)诩膊“l(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要的影響[1]。通常情況下，惡性腫瘤患者基因DNA的甲基化表達(dá)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，不過(guò)特定區(qū)域的基因則呈現(xiàn)出高甲基化特點(diǎn)。本研究旨在分析AML以及MDS患者的DNA甲基化表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年5月～2017年5月我院收治的急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者40例為研究組，男22例，女18例，年齡23～59歲，平均（36.2±1.3）歲，病程2～9年，平均（5.4±0.6）年，其中高?；颊?8例，低?；颊?2例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者確診符合急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合征；未合并其他血液系統(tǒng)疾??；知情同意本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤患者；合并嚴(yán)重肝腎功能障礙患者；妊娠哺乳期女性。選取同期健康體檢人員40例為對(duì)照組，男25例，女15例，年齡24～58歲，平均（35.4±1.2）歲。兩組研究對(duì)象的一般資料比較，無(wú)明顯差異（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理方法 采集研究對(duì)象骨髓標(biāo)本3 mL，采集得到的標(biāo)本首先使用肝素處理從而發(fā)揮抗凝效果，標(biāo)本經(jīng)過(guò)抗凝處理后進(jìn)行核細(xì)胞的提取操作。若未能收集到患者或健康研究獨(dú)享的新鮮骨髓標(biāo)本，則需要選用凍存細(xì)胞或者染色體懸液[2]。

1.2.2 分離白細(xì)胞 將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到離心管中，1000 g條件下持續(xù)離心10 min。去除上清血漿之后添加紅細(xì)胞裂解液之后持續(xù)裂解3 min。1000 g條件下再次離心10 min后去除上清液，如果仍然存在紅細(xì)胞需要再次進(jìn)行裂解。添加10 mL的PBS磷酸緩沖液之后均勻進(jìn)行吹打，離心10 min后去除上清液。添加PBS 2 mL之后轉(zhuǎn)移到離心管中。10000轉(zhuǎn)高速條件下持續(xù)離心30 s之后去除上清，-60℃條件下儲(chǔ)存。

1.2.3 DNA提取 應(yīng)用DNA試劑盒進(jìn)行白細(xì)胞DNA的提取，從冰箱中取出研究對(duì)象骨髓標(biāo)本，添加500 μL的裂解液，45℃條件下持續(xù)孵育15 min。取出完全裂解之后的骨髓標(biāo)本，添加120 μL的蛋白沉淀劑，充分震蕩之后10000 r/min持續(xù)離心10 min。將得到的上清液轉(zhuǎn)移到EP管，使用異丙醇并且進(jìn)行充分的震蕩，后以 10000 r/min的速度持續(xù)進(jìn)行離心處理3 min。

1.2.4 亞硫酸氫鹽DNA修飾 應(yīng)用EpiTect進(jìn)行DNA標(biāo)本的修飾。操作步驟方面，將Bisulfite分裝管中添加1000 μL的去Rnase并混勻，之后添加DNA溶解，將Bisulfite所需成分添加到PCR管中。PCR管合上并且充分混勻，常溫條件下放置。添加Protect Buffer時(shí)，若顏色從綠變藍(lán)，即可停止添加，pH已經(jīng)滿足反應(yīng)所需條件。之后行DNA的修飾反應(yīng)，將PCR管放置到Thermal中，完成修飾反應(yīng)后持續(xù)離心PCR管1 min。完成離心之后轉(zhuǎn)移反應(yīng)液到離心管中。將含有10 ng/mL的RNA BufferBL添加到離心管中，混勻后持續(xù)離心1 min。轉(zhuǎn)移離心管中的溶液到Epitectspincolumns，10000 r/min持續(xù)離心30 s 后去除上清。添加Buffer BW 300 μL到各個(gè)spincolumn中，10000 r/min持續(xù)離心30 s 后去除上清。添加Buffer BD 300 μL到spincolumn中，合上蓋子后常溫條件下持續(xù)孵育30 min。10000 r/min持續(xù)離心30 s之后去除上清。若BufferBD中存在沉淀物，則不能直接添加到spincolumns中，每次使用BufferBD后需蓋上瓶蓋，避免同空氣中的二氧化碳接觸而發(fā)生酸化問(wèn)題。添加BufferBW 300 μL到spincolumn中，最大轉(zhuǎn)速離心1 min，10000 r/min持續(xù)離心30 s之后去除上清，將其放置到collectiontubes中，重復(fù)操作之后將spincolumns放置到新的collectiontubes中，10000 r/min持續(xù)離心2 min去除液體。打開spincolumns蓋子并轉(zhuǎn)移到離心管中，45℃條件下持續(xù)孵育10 min，每個(gè)spincolumns薄膜添加BufferEB 20 μL，10000 r/min持續(xù)離心2 min，洗脫純化之后的DNA，為提高洗脫的效果從而加大DNA的產(chǎn)量，應(yīng)當(dāng)額外添加BufferEB 20 μL，將純化之后的DNA-30℃條件下儲(chǔ)存。

1.2.5 甲基化PCR 應(yīng)用甲基化引物（M）以及非甲基化引物（U）PCR擴(kuò)增硫化之后的DNA，反應(yīng)條件方面，在80℃條件下進(jìn)行預(yù)變性，持續(xù)時(shí)間為20 min，之后80℃條件下持續(xù)變性1 min，45℃條件下退火1 min，69℃條件下延伸30 s，反復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，69℃條件下延伸5 min，常溫條件下保存PCR得到產(chǎn)物。

1.2.6 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè) 取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用2.0%的瓊脂糖膠，在110 V條件下持續(xù)電泳1 h，使用100bpMarker標(biāo)記DNA的分子量，從而檢測(cè)擴(kuò)增片段。后對(duì)電泳得到的凝膠進(jìn)行系統(tǒng)照像，分析電泳條帶的灰度值（Int值），從而判斷DNA的甲基化水平。

1.3觀察指標(biāo)

對(duì)兩組研究對(duì)象的骨髓標(biāo)本進(jìn)行甲基化PCR，分別檢測(cè)其PAX6基因、GDNF基因及TJP1基因的條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢檢，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組PAX6甲基化水平比較

研究組患者PAX6甲基化表達(dá)明顯高于對(duì)照組健康人群（P<0.05），同時(shí)高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組PAX6甲基化水平比較（x±s，copies/10000abl copies）

2.2 兩組研究對(duì)象GNDF甲基化水平比較

研究組患者GNDF甲基化表達(dá)明顯高于對(duì)照組健康人群（P<0.05），同時(shí)高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），見(jiàn)表2。

2.3兩組研究對(duì)象TJP1甲基化水平比較

研究組患者TJP1甲基化表達(dá)明顯高于對(duì)照組健康人群（P<0.05），同時(shí)高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組研究對(duì)象TJP1甲基化水平比較

（x±s，copies/10000abl copies）

3討論

急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征是一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)疾病，支持治療、傳統(tǒng)化療及干細(xì)胞移植治療為常用的治療方法，但化療易導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥及復(fù)發(fā)問(wèn)題，而移植造血干細(xì)胞的失敗幾率較高，患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)同樣較高，治療效果均不夠理想[3-4]。隨著臨床上DNA甲基化相關(guān)研究的日益深入，各種去甲基化治療的藥物種類越來(lái)越多，同時(shí)逐漸應(yīng)用于白血病患者的治療過(guò)程中。DNA甲基化指的是DNA在轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的影響作用下，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）能夠源源不斷地提供甲基從而轉(zhuǎn)化成為5-甲基胞嘧啶，不斷合成甲基化DNA[5-6]。甲基化產(chǎn)物能夠形成CpG位點(diǎn)，而相關(guān)研究的結(jié)果提示，人類的基因組中包含2000萬(wàn)以上的CpG位點(diǎn)，有60%左右的CpG苷酸屬于甲基化狀態(tài)，少數(shù)非甲基化的CpG雙核苷酸呈現(xiàn)出集聚的傾向，從而形成GC水平較高同時(shí)CpG苷酸比較密集的位置，研究人員稱之為CpG島[7]。CpG島通常存在于基因啟動(dòng)子以及外顯子的位置。

近年來(lái)隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展具體機(jī)制的深入探討，腫瘤基因啟動(dòng)子位置的甲基化對(duì)血液系統(tǒng)疾病的影響日益受到人們的重視[8-9]?；騿?dòng)子的高甲基化狀態(tài)是影響急性髓系白血病患者的預(yù)后質(zhì)量的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。遺傳學(xué)研究的結(jié)果表明，甲基化異常是部分白血病的典型特點(diǎn)，通常與已知染色體異位及基因突變存在聯(lián)系[10-11]。研究人員發(fā)現(xiàn)白血病相關(guān)IDH基因突變會(huì)導(dǎo)致PAX6基因出現(xiàn)甲基化異常，且影響到造血干細(xì)胞的正常分化[12]。本研究結(jié)果顯示，研究組患者PAX6甲基化表達(dá)明顯高于對(duì)照組健康人群（P<0.05），同時(shí)高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），與相關(guān)研究結(jié)果相符。最新研究結(jié)果顯示，髓系血液腫瘤患者的細(xì)胞株及白血病患者中，PAX6基因高甲基化同基因沉默存在不容忽視的聯(lián)系。PAX6高表達(dá)在急性髓系白血病患者中出現(xiàn)的幾率較高，正常突變通常情況下并不會(huì)設(shè)計(jì)甲基化[13]。本研究應(yīng)用亞硫酸氫鹽測(cè)序白血病患者的骨髓標(biāo)本甲基化。這一技術(shù)與其他的DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)比較而言有著更高的靈敏度，借助于對(duì)基因組的DNA完成測(cè)序能夠得到精確度比較高的甲基化圖譜，同時(shí)也能夠發(fā)現(xiàn)同基因激活或基因沉默存在聯(lián)系的CpG位點(diǎn)具體位置，且分析甲基化情況，即能可靠直接地體現(xiàn)DNA的甲基化程度[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，乳腺瘤患者及膠質(zhì)瘤患者中的GNDF基因高表達(dá)且伴隨著驅(qū)動(dòng)子的高甲基化，并非高表達(dá)合并甲基化[15]。5-氮雜脫氧胞嘧啶核苷可以降低GNDF基因的甲基化水平，但在此過(guò)程中不會(huì)影響到GNDF的表達(dá)量。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，研究組患者GNDF甲基化表達(dá)明顯高于對(duì)照組健康人群（P<0.05），同時(shí)高危患者甲基化水平明顯高于低?；颊撸≒<0.05），提示急性髓系白血病患者的骨髓GNDF基因甲基化水平要顯著高于健康人群，而健康人群的GNDF基因甲基化水平比較低。研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因高甲基化是血液惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，DNA甲基化能夠改變DNA結(jié)構(gòu)，不過(guò)并不會(huì)對(duì)DNA序列帶來(lái)影響[16]。近年來(lái)臨床上去甲基化藥物如地西他濱及阿扎胞苷在白血病等血液系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用日益廣泛，主要借助于逆轉(zhuǎn)甲基化的過(guò)程，從而重新激活抑癌基因，發(fā)揮白血病治療效果[17]。

本研究結(jié)果提示，研究組患者TJP1甲基化表達(dá)明顯高于對(duì)照組健康人群（P<0.05），同時(shí)高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），提示TJP1甲基化異常在AML/MDS發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中有不容忽視的重要影響。同腫瘤遺傳學(xué)不同的是，人體表觀遺傳學(xué)層面出現(xiàn)的改變，可以借助藥物來(lái)改變其表達(dá)水平[18-19]。PAX6（pairedbox6）基因全稱為配對(duì)核因子6基因，屬于PAX轉(zhuǎn)錄因子家族的重要組成部分。GDNF屬于TGF-β家族，相關(guān)研究結(jié)果表明PAX6及GDNF基因在MDS患者的身體內(nèi)部存在著高甲基化的傾向。TJP1屬于ZO-1基因，隨著患者腫瘤惡性程度的上升而呈現(xiàn)出表達(dá)水平降低的趨勢(shì)，表明該基因與腫瘤演進(jìn)存在密切聯(lián)系?？傊珼NA甲基化異常在血液系統(tǒng)疾病發(fā)生過(guò)程中有重要作用，主要體現(xiàn)在抑癌基因甲基化水平的上升[20]。DNA啟動(dòng)子位置甲基化異常能作為患者病情診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，因此，對(duì)DNA甲基化的研究對(duì)診斷及治療惡性血液疾病有重要的臨床價(jià)值。地西他濱是臨床上常用的去甲基化藥物之一，在惡性血液病治療領(lǐng)域取得理想應(yīng)用效果，高劑量用藥與化療藥物的細(xì)胞毒性類似，同時(shí)骨髓抑制作用也較明顯，低劑量用藥則主要實(shí)現(xiàn)去甲基化的影響，從而控制腫瘤細(xì)胞增殖。不過(guò)當(dāng)前情況下AML/MDS去甲基化的致病作用機(jī)制還需要后續(xù)研究，去甲基化治療也需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

綜上所述，急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者的PAX6、GNDF、TJP1表達(dá)均呈現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)，且表達(dá)水平與患者病情存在正相關(guān)，可以作為臨床診斷以及判斷患者預(yù)后的依據(jù)。

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（收稿日期：2017-12-08）