吳光忠，何炯靈，黃炳文，蔣予箭*

(1.紹興至味食品有限公司，浙江 紹興 312050；2.浙江工商大學 食品與生物工程學院，杭州 310012)

果醋是以水果為主要原料，經酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵釀制而成的一種營養(yǎng)豐富、風味優(yōu)良的飲品，糧醋是以大米等糧食為主要原料經酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵釀制而成的一種酸性調味品[1]。近幾年來，在果醋的風味組成、醋酸發(fā)酵過程控制、固定化發(fā)酵方式及耐高酸度醋酸菌選育等方面有較多研究，相比之下，對果醋、米醋發(fā)酵產品的市場開發(fā)的研究就顯欠缺[2-4]。把糧醋的發(fā)酵與果醋的發(fā)酵相結合，一方面降低了果醋的生產成本，另一方面拓寬了糧醋的應用市場。本實驗以獼猴桃果汁和糯米為原料分別生產果酒、米酒，按一定比例將米酒、果酒混合，接種醋酸菌發(fā)酵，制得果香型米醋[5]。用氣質聯用色譜和高效液相色譜對不同比例果酒、米酒混合發(fā)酵的果醋樣品進行香氣成分和有機酸含量的檢測，考察不同果酒、米酒配比下發(fā)酵制得的果香型米醋的風味特征，為開發(fā)此類新產品積累科學數據[6-11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米、獼猴桃：購于超市；安琪果酒活性干酵母：湖北安琪酵母有限公司；果膠酶：江蘇銳陽生物科技有限公司；滬釀1.01醋酸菌：上海迪發(fā)生物有限公司。

甲醇為色譜級，磷酸二氫銨為分析純，草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸標準品的純度均大于99%。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；LC-2010A HT高效液相色譜儀 日本島津有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；ATC手持式糖度儀 南京科航實驗儀器有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

工藝流程圖見圖1。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram

1.3.2 果醋發(fā)酵工藝

1.3.2.1 獼猴桃汁酶解

成熟獼猴桃經過剝皮、破碎、打漿之后，加入0.08%的果膠酶[12]，在50 ℃水浴中酶解2 h，然后再將水浴溫度調至80 ℃，保持15 min，解除果膠酶的活性。冷卻至室溫后，用蔗糖或者白砂糖調糖酸比至手持式糖度儀測定讀數為20 °Bx。

1.3.2.2 酵母菌活化

用天平稱取7 g活性干酵母加入到100 mL、2%已滅過菌的葡萄糖溶液中，用38 ℃水浴鍋活化45 min，得到活化好的酵母菌。

1.3.2.3 獼猴桃汁酒精發(fā)酵

用血球計數法計算酵母菌液中的酵母數[13]，按1×107個/mL接種量計算所需酵母原液量加入到果汁中，攪勻后置于錐形瓶中并用牛皮紙封口，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約5天，當酒精度不再上升時酒精發(fā)酵結束。

1.3.2.4 醋酸發(fā)酵

大量文獻表明醋酸發(fā)酵的最佳酒精度為6%(V/V)[14,15]，故將獼猴桃酒和米酒的酒精度均調至6%后按照不同比例混合，接種10%的醋酸菌，置于30 ℃發(fā)酵至酸度不再上升。

1.3.3 香氣成分的測定方法

取樣品5 mL置于20 mL頂空瓶中，然后用帶有硅橡膠隔墊的瓶蓋密封。將頂空瓶放入50 ℃水浴鍋平衡30 min，然后將萃取頭插入頂空瓶中距離液面2 cm處，50 ℃下吸附30 min，取出后插入GC進樣口，240 ℃下解吸2 min，進行GC-MS分析。

色譜柱：DB-WAX，60 m×0.25 mm×0.5 μm(柱長×內徑×膜厚)；進樣口溫度：240 ℃，不分流進樣，載氣為氦氣，恒流模式，柱流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃，保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；質量數掃描范圍：33～500 amu。

1.3.4 有機酸的測定方法

用電子天平準確稱取草酸40 mg，蘋果酸及酒石酸各200 mg，抗壞血酸30 mg，乳酸500 mg，醋酸6000 mg，檸檬酸700 mg以及琥珀酸180 mg，用超純水定容至100 mL，混合均勻后從中吸取1,3,5,7,9 mL，分別用超純水定容到10 mL,配成不同濃度的混合標樣，用0.45 μm有機系微孔濾膜過濾后,繪制各有機酸的標準曲線。

通過前期的實驗得到的液相色譜條件為：色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速： 0.5 mL/min；柱溫：25 ℃； 檢測波長：210 nm； 進樣體積：5 μL；流動相：5 g/L磷酸二氫銨(磷酸調pH至2.5)。

將發(fā)酵好的米醋、獼猴桃醋以及用米酒、獼猴桃酒不同比例混合發(fā)酵的混合果醋在15000 r/min的條件下離心20 min后過0.45 μm微孔濾膜，進行HPLC定量分析，每個樣品進樣3次，取平均值。

1.3.5 感官評價方法

根據果醋感官評定規(guī)則，對純獼猴桃醋、米醋以及用不同比例混合的獼猴桃酒和米酒發(fā)酵而成的果醋進行感官評定，感官評價員為10人(3人來自果醋釀造企業(yè)，7人來自實驗室，都經過相關的感官鑒定培訓)，總分為100分，每次將10名評價員的結果進行平均，可在備注欄里寫上對該樣品的評價。由于原醋酸度較大，故在進行滋味品嘗時先稀釋一定的、相同的倍數。自制果醋的感官評價標準見表1。

表1 自制果醋的感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of self-made fruit vinegar

1.3.6 理化指標測定

酒精度測定：蒸餾法；

總酸含量測定：酸堿中和滴定法；

還原糖測定：斐林試劑法。

2 結果與分析

2.1 香氣物質檢測結果

用頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用法分析比較了稀釋到6%的獼猴桃酒、米酒混合果酒，兩者單獨發(fā)酵而成的果醋以及混合發(fā)酵產生的果醋的香氣成分[16]。共分離鑒定了52種香氣成分(見表2)，主要包括酸類、醇類、酯類、醛類、酮類以及酚類這6種化合物，其相對含量比較見表3。

表2 4種樣品香氣成分GC-MS分析結果Table 2 GC-MS results of aroma components of four samples

續(xù) 表

表3 各樣品香氣物質種類及其含量比較Table 3 Comparison of aroma components and their content in various samples

由表2和表3可知，采用GC-MS在4種樣品中共鑒定出52種香氣成分，這些成分包括酸類11種、醇類12種、酯類20種、醛類3種、酮類3種、酚類3種。對于果醋來說，含量最多的為酸類香氣物質(主要為醋酸)，相對含量依次為：純獼猴桃酒發(fā)酵醋(77.93%)>果酒米酒混合發(fā)酵果醋(58.31%)>米醋(44.85%)，其酸的種類也有所差異，依次為：混合果醋(11種)>米醋(9種)>獼猴桃醋(8種)，由此可看出混合發(fā)酵果醋的酸類香氣物質相對含量介于獼猴桃醋和米醋之間，但酸的種類比兩者都要高，這有利于增加果醋的風味和嗅覺感受。在醇類含量方面，相對含量和種類均為混合發(fā)酵的果醋最佳。酯類化合物主要是在發(fā)酵過程中由有機酸與醇發(fā)生酯化反應以及微生物代謝形成的，能產生果香味和花香味，米醋中酯類所占比例較高，達37.6%，其中以乙酸異戊酯、琥珀酸二乙酯、乙酸苯乙酯含量較多，但種類是混合發(fā)酵果醋最高，有15種之多。此外，香氣成分中的醛類、酮類和酚類種類均為混合果醋>米醋>獼猴桃醋?？偟膩砜?，3種果醋的香氣成分種類數量依次為：混合果醋(43種)>米醋(33種)>獼猴桃醋(32種)。故將獼猴桃酒和米酒混合后發(fā)酵可以集合兩者的風味，使得果醋中的香氣成分大大增加，酸味更醇厚，醇、酯類香氣物質增加，香氣更加協調和多樣，提高果醋的品質。

2.2 有機酸檢測結果

將發(fā)酵好的米醋、獼猴桃醋以及用米酒、獼猴桃酒按不同比例混合發(fā)酵的混合果醋分別進樣檢測各特征性有機酸，其HPLC分析圖譜見圖2，測定的有機酸含量見表4。

圖2 等比例混合發(fā)酵果醋中有機酸HPLC分析色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of fruit vinegar fermented by equal amount of kiwi wine and rice wine

有機酸種類有機酸含量(g/dL)果酒米醋獼猴桃醋獼∶米為3∶1獼∶米為2∶1獼∶米為1∶1獼∶米為1∶2獼∶米為1∶3草酸0.01220.01130.02350.02890.02880.01970.01750.0157酒石酸0.09740.06810.16350.18340.17690.14580.14110.0913蘋果酸0.04440.0390.03870.04650.04370.03970.03720.0303抗壞血酸0.05190.00790.0310.04440.04730.03520.03120.0159乳酸0.29840.27420.05330.10190.12460.15040.16770.1991醋酸0.19094.32185.82585.43094.89445.36165.0444.6365檸檬酸0.24130.10160.48820.73860.52860.48180.36980.213琥珀酸0.0310.03810.11790.01370.09930.08250.06610.0947特征性總酸0.96754.8626.74196.58835.94366.31675.87465.2965

由圖2和表4可知，各樣品特征性總酸含量為：純獼猴桃醋>獼猴桃酒米酒(3∶1>1∶1>2∶1>1∶2>1∶3)發(fā)酵果醋>純米酒醋，說明不同比例米酒和獼猴桃酒混合后發(fā)酵生產的果醋中的特征性有機酸含量差異較大。其中草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、檸檬酸都隨著混合果酒中的獼猴桃汁含量減少而減少，且在米酒的添加量少于獼猴桃酒時這幾種酸的含量均大于純獼猴桃汁發(fā)酵，由此可看出混合果醋中這幾種特征性有機酸主要是由獼猴桃汁發(fā)酵產生的，而少量添加米酒(米酒所占比例少于果酒)時又可以促進這幾種有機酸的產生。乳酸隨著米酒含量的增加而有所上升，說明這種有機酸大部分來源于米酒發(fā)酵。發(fā)酵產生的醋酸含量為：純獼猴桃醋>獼∶米(3∶1>1∶1>1∶2>1∶3>2∶1)>純米醋，說明配比不同產生的醋酸含量有所不同，可能原因是不同配比產生的不同生長環(huán)境對于醋酸菌的生長和產酸能力產生了較大的影響。由此可以得出，在獼猴桃酒發(fā)酵時混入適量米酒可以增加非揮發(fā)性有機酸的含量，從而增加果醋的風味。

2.3 不同比例混合發(fā)酵果醋感官評價結果

將獼猴桃酒和米酒以不同比例混合進行發(fā)酵產生的果醋從色澤、香氣、滋味和形態(tài)這4個方面進行感官評價，由10名評價員進行打分，總分以各項平均分計，結果見表5。

表5 不同比例混合發(fā)酵的果醋感官評價結果Table 5 Results of sensory evaluation of fruit vinegar mixed with different proportions

由表5可知，當獼猴桃酒和米酒的混合比例不同時，其發(fā)酵產生的果醋的風味也有所不同。從色澤和形態(tài)方面來看，純獼猴桃汁發(fā)酵的果醋色澤亮度較好，澄清度高，而當米酒的加入量過多時，會使得果醋的色澤變得較為暗淡，但適量地加入米酒可以使果醋的色澤呈現較好看的琥珀色。從香氣方面來看，純獼猴桃酒發(fā)酵而成的果醋雖果香味較好，但醋酸味較刺鼻，且酯香等其他香氣成分不明顯，米酒的加入可以增加果醋的酯香等香氣成分，調和酸味，使得香氣成分更加協調，但當米酒的加入量超過獼猴桃酒時又會使果香味顯得不足。從滋味方面來看，當米酒的混合量不超過獼猴桃酒時，會使得發(fā)酵果醋酸味柔和，略帶甘甜，滋味較佳。從綜合評分可以看出，當獼猴桃酒和米酒以1∶1或者2∶1混合發(fā)酵時產生的果醋風味最佳。

3 結論

用頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用法(HS-SPME-GC-MS)分析比較了純獼猴桃、純米酒以及兩者混合發(fā)酵的果醋的香氣成分，共分離鑒定了52種香氣成分，主要是酸類、醇類、酯類、醛類、酮類以及酚類這6種化合物，發(fā)現混合發(fā)酵果醋的總的香氣成分最多，共有43種，且每種香氣成分種類均大于或等于獼猴桃和米酒單獨發(fā)酵產生的醋，由此可說明在獼猴桃酒發(fā)酵過程中添加米酒可以增加果醋的各方面香氣成分，使香氣更加協調多樣。

加入適量米酒可以增加除醋酸外的特征性有機酸的含量，使酸味柔和、醇厚。從感官評價分析可看出，當獼猴桃汁和米酒的混合比例為1∶1或者2∶1時，其口感較佳，評分較高。再結合成本考慮，米酒的價格遠低于獼猴桃汁，故本實驗將最后的配比定為6%獼猴桃酒∶6%(V/V)米酒為1∶1。

綜上，將米酒作為原料加入到果醋的發(fā)酵中，可以在降低果醋生產成本的同時為米酒的開發(fā)利用提供新的途徑，此外，米酒的適量加入還可以增加果醋的香氣物質種類和特征性有機酸含量，有利于改善果醋風味，提高果醋的品質，可以為今后果醋行業(yè)的發(fā)展提供一種新的思路和研究方向。