許金根, 蔡治華, 王立克

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

CD4蛋白為CD4+T細(xì)胞表面的標(biāo)志物，是動(dòng)物機(jī)體中的一種重要免疫分子。CD4主要表達(dá)于輔助性T細(xì)胞，通過(guò)識(shí)別MHCⅡ類分子結(jié)合的抗原而參與免疫應(yīng)答[1-2]。CD4是研究動(dòng)物免疫性狀的重要功能候選基因，已報(bào)道CD4序列遺傳變異與畜禽的疾病或免疫性狀相關(guān)。比如，CD4基因甲基化程度與奶牛的乳房炎相關(guān)[3]，而CD4基因變異與小型豬的血清IgG濃度相關(guān)[4]。選擇性剪接是真核生物基因一個(gè)前體mRNA通過(guò)不同剪接方式產(chǎn)生多個(gè)剪接異構(gòu)體，從而表達(dá)具有不同生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，是形成生物多樣性的一種重要方式[5]。研究表明，動(dòng)物體的CD4基因存在選擇性剪接現(xiàn)象。在小型豬中發(fā)現(xiàn)兩種CD4分子，但兩種CD4類型豬的CD3+和CD8+細(xì)胞數(shù)以及血清IgG和IgM濃度都沒(méi)有顯著差異[6]。另外，本人已在大白豬血液和組織中檢測(cè)到兩種相差外顯子8(長(zhǎng)122 bp)的CD4 mRNA序列，導(dǎo)致兩者編碼的CD4蛋白相差60個(gè)氨基酸[7]。但這種CD4基因整個(gè)外顯子8缺失現(xiàn)象，尚未在奶牛等其他畜禽研究中報(bào)道。

基于前期在豬CD4基因外顯子8處檢測(cè)到的選擇性剪接體。因此，本試驗(yàn)利用反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)和測(cè)序，檢測(cè)奶牛CD4基因外顯子8處的剪接體，為研究奶牛CD4基因的結(jié)構(gòu)和功能提供相應(yīng)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集1頭成年荷斯坦奶牛3 mL尾靜脈血，立即加入9 mL RNAfixer保護(hù)劑(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)充分混合，靜置10 min后于-70 ℃保存。用RNA提取試劑盒(QIAGEN凱杰生物技術(shù)有限公司)提取血液總RNA，經(jīng)NanoDrop核酸分析儀測(cè)定其濃度和純度，質(zhì)檢合格后(OD260/280在1.8～2.0，OD260/230>1.8)，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)普通牛(Bos taurus) CD4基因序列(ENSBTAG00000003255)，并結(jié)合NCBI牛CD4 mRNA序列(GenBank: AB674571.1)，通過(guò)序列比對(duì)區(qū)分出牛CD4基因各外顯子的位置。用Primer 5.0軟件在牛CD4基因的外顯子8兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物(表1)，用RT-PCR擴(kuò)增和鑒定CD4外顯子8處的剪接體。

表1 牛CD4基因擴(kuò)增引物

1.3 RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序

以奶牛血液cDNA為模板，用引物擴(kuò)增CD4基因外顯子8兩側(cè)序列。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。將PCR產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，用DNAMAN軟件比對(duì)序列，并用Chromas軟件查看測(cè)序峰圖。

1.4 序列分析

通過(guò)在線序列比對(duì)(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)，比較分析不同CD4剪接體序列，并尋找單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛CD4基因剪接體鑒定

用RT-PCR在奶牛CD4基因外顯子8處檢測(cè)到兩種剪接體，與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度542和420 bp一致，分別命名為CD4-1和CD4-2，且CD4-1在血液中的表達(dá)量高于CD4-2(圖1)。

圖1 牛CD4基因外顯子8處剪接體擴(kuò)增

2.2 奶牛CD4基因擴(kuò)增序列分析

通過(guò)與GenBank (AB 674571.1)公布的普通牛CD4序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)擴(kuò)增的CD4-1序列(去除兩端測(cè)序較差序列)與其高度一致(圖2a)，表明擴(kuò)增的是牛CD4基因部分mRNA序列。另外，通過(guò)測(cè)序，在CD4基因外顯子8的第64位，檢測(cè)到1個(gè)SNP (C/A變異) (圖2b)。

圖2 牛CD4基因外顯子8處序列分析

2.3 兩種奶牛CD4剪接體序列分析

通過(guò)序列比對(duì)分析(去除兩端測(cè)序較差序列)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的牛CD4-1和CD4-2序列長(zhǎng)度相差122 bp (圖3)，為整個(gè)外顯子8缺失。

3 結(jié)論與討論

前期研究結(jié)果表明，豬CD4 mRNA發(fā)現(xiàn)存在兩種相差122 bp(缺失整個(gè)外顯子8)的序列，兩者編碼的蛋白質(zhì)相差60個(gè)氨基酸(GenBank: KC 333253和KC 333254)[7]。本研究利用RT-PCR和測(cè)序，在奶牛血液中檢測(cè)到兩種相差122 bp(缺失外顯子8)的CD4 mRNA序列，且剪接型CD4表達(dá)量較低。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(ID: AB 674571.1和NM 001103225.1)和Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(ID: ENSBTAT00000037742.4和ENSBTAT00000004219.4)都公布有兩種牛CD4 mRNA序列，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)短的編碼區(qū)也是缺失長(zhǎng)122 bp的外顯子8，導(dǎo)致兩者編碼的蛋白質(zhì)相差60個(gè)氨基酸，表明牛CD4基因外顯子8處存在選擇性剪接現(xiàn)象。

圖3 牛CD4基因外顯子8處兩種剪接體序列分析

此外，通過(guò)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其他物種CD4基因mRNA序列，發(fā)現(xiàn)人(ENST 00000011653.8)、綿羊(ENSOART 00000006854.1) CD4基因的第8外顯子都是長(zhǎng)122 bp，但是否也存在缺失整個(gè)外顯子8的現(xiàn)象仍需驗(yàn)證。已有報(bào)道，利用單克隆抗體CC26鑒定出牛CD4蛋白存在不同的異構(gòu)體[8]。鑒于CD4蛋白是維持和發(fā)揮CD4+ T細(xì)胞免疫功能的重要分子，故表達(dá)不同CD4蛋白的個(gè)體間免疫應(yīng)答能力可能存在差異。本試驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)了牛CD4基因外顯子8缺失，但剪接型CD4蛋白在機(jī)體中的生理功能有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牛CD4基因外顯子8存在缺失，并檢測(cè)到外顯子8有一個(gè)SNP，為研究CD4基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定一定基礎(chǔ)。