劉攀道，羅佳佳,2，白昌軍，陳志堅*，劉國道*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所,農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 海南 儋州571737；2.海南大學熱帶農(nóng)林學院，海南 ?？?70228)

錳是植物生長所必需的微量元素之一，在植物生長發(fā)育和生命活動的代謝過程中起重要作用[1]。錳參與光合作用中電子傳遞系統(tǒng)的氧化還原和光系統(tǒng)II中水的光解過程[1]。錳還可參與ATP合成、脂肪酸和蛋白質(zhì)的代謝過程[2]。在我國可耕作土壤中，錳平均含量可達573 mg·kg-1，并且，我國土壤錳含量表現(xiàn)出南方酸性土壤錳含量高于北方的石灰性土壤[3-4]。在酸性土壤中，由于低氧化還原電勢和低pH，錳以可溶性的形態(tài)進入土壤溶液，導致錳含量顯著增加，過量積累的錳離子會對植物細胞造成毒害，抑制植物生長[5-6]。

錳毒害癥狀主要表現(xiàn)在葉片上，如出現(xiàn)褐色錳氧化斑、壞死斑和葉片失綠等[1]。錳毒害抑制葉片光合作用，破壞多種重要代謝酶的活性，產(chǎn)生活性氧自由基造成氧化脅迫，影響根系對其他營養(yǎng)元素的吸收、運輸和分配，破壞根系組織結(jié)構(gòu)[1,7]。植物的耐錳機制主要包括把過量的錳積累在液泡和細胞壁等非活性部位、增強錳毒害下抗氧化能力、增加根系分泌物螯合根際錳離子減少根系對錳的吸收[6,8]。不同植物品種或植物的不同基因型的耐錳能力不一樣。

柱花草(Stylosanthesspp.)是主要的熱帶豆科牧草，起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，可作為飼料喂養(yǎng)牲畜、作為綠肥覆蓋果園以及培肥和改良土壤等，具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)效益。一般認為，起源于酸性土壤的熱帶植物表現(xiàn)出較強的適應酸性土壤生長的能力，其可能具有獨特的耐酸鋁和酸錳脅迫的機制[9]，因此，柱花草是研究酸性土壤錳毒害脅迫機制的良好材料。研究表明，葉片失綠和皺縮是柱花草錳毒害的主要癥狀[5]。并且，增加柱花草根系蘋果酸的合成與分泌，可以減少根系對錳的吸收，進而緩解錳毒害[10]。目前，已有針對錳毒脅迫影響柱花草生長、元素平衡等方面的研究，但是，柱花草響應錳毒害是一個復雜生理過程，對不同基因型及不同生長期柱花草響應錳毒害的研究較少，柱花草是否可以通過維持根系生長及提高抗氧化脅迫的能力緩解錳毒害仍不清楚。因此，本研究以2份柱花草基因型為材料，分析不同錳濃度處理對苗期柱花草根系生長和抗氧化酶活性等的影響，以期為探索柱花草耐錳機理及耐錳柱花草品種改良提供理論依據(jù)及種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的2份圭亞那柱花草(Stylosanthesguianensis)基因型分別為TF210和TF226。柱花草種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室提供。

1.2 方法

1.2.1實驗處理 參照陳志堅等[5]方法，柱花草種子去除外種皮后，80 ℃加熱2 min，冷卻后于黑暗條件下催芽2～3 d，然后，柱花草幼苗移栽至14 L塑料盆中于溫室進行營養(yǎng)液培養(yǎng)。試驗于2017年4月進行。培養(yǎng)溫度為28 ℃/25 ℃(晝/夜)，濕度75%，光照強度800 μmol·m-2·s-1。營養(yǎng)液為1/2 Hoagland溶液，每7 d更換1次營養(yǎng)液，每2 d用KOH或H2SO4調(diào)節(jié)pH值至5.8。參照Chen等[10]方法，幼苗生長1個月后，移栽至含有不同錳濃度的1/2 Hoagland營養(yǎng)液中處理7 d。錳濃度分別為5 μmol·L-1(對照)和400 μmol·L-1MnSO4(過量錳處理)，營養(yǎng)液pH為5.0，每個處理設置4個重復。每2 d用KOH或H2SO4調(diào)節(jié)pH值至5.0。處理7 d后，對柱花草活體葉片進行葉綠素和最大光化學效率(Fv/Fm)測定。對一部分植株分別收取地上部和根部樣品，根系用去離子水沖洗干凈，用于根系參數(shù)分析后，地上部和根部樣品在75 ℃下烘干至恒重，稱取干重；另一部分植株葉片樣品用液氮速凍，然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于酶活性分析。

1.2.2測定方法 根系用EPSON 1640XL掃描儀(EPSON，日本)進行掃描，總根長和根體積用WinRhizo軟件(Regent Instruments，加拿大)進行分析。采用SPAD502型葉綠素分析儀測定葉綠素含量，用便攜式熒光儀Pocket PEA(Hansatech，英國)測定葉片最大光化學效率(Fv/Fm)。柱花草葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，過氧化物酶(peroxidase，POD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用試劑盒進行測定，試劑盒購買于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。以上每個指標測定設置4個重復。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2003作圖，用SPSS 20.0(SPSS Institute，美國)軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同錳濃度處理對柱花草生長的影響

如圖1所示，相對對照(5 μmol·L-1)處理，過量錳(400 μmol·L-1)處理均顯著抑制了柱花草基因型TF210的地上部(F=9.2，P<0.05)和根部(F=9.2，P<0.05)干重。在過量錳處理下，TF210地上部和根部干重相對對照分別降低了27.1%和17.6%，差異顯著(P<0.05)(圖1)。但是，過量錳處理對基因型TF226地上部和根部干重影響不明顯(圖1)。

圖1 不同錳處理對柱花草地上部和根部干重的影響Fig.1 Shoots and roots dry weight of stylo at different Mn treatments 不同小寫字母表示同一柱花草種質(zhì)在不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Different letters indicated significant difference among different treatments at P<0.05 level in the same stylo accession, the same below.

2.2 不同錳濃度處理對柱花草根系生長的影響

從圖2可以看出，過量錳(400 μmol·L-1)處理顯著抑制了柱花草基因型TF210的主根長(F=5.9，P<0.05)和總根長(F=10.5，0.010.05)。在過量錳處理下，TF210主根長和總根長相對對照分別降低了14.0%和31.5%(圖2)。但是，過量錳處理對基因型TF226主根長、總根長和根體積均無顯著影響(圖2)。因此，在過量錳處理下，基因型TF226能夠維持根系生長。

2.3 不同錳濃度處理對柱花草葉綠素濃度(SPDA)及最大光化學效率(Fv/Fm)的影響

過量錳(400 μmol·L-1)處理顯著降低了柱花草葉綠素濃度(SPDA)(F=36.4，P<0.001)(圖3)。在過量錳處理下，TF210和TF226的SPDA值相對對照分別降低了35.8%和20.0%，并且，在過量錳處理下，基因型TF226的 SPDA值顯著高于TF210(P<0.05)(圖3)。

過量錳處理顯著影響柱花草最大光化學效率(Fv/Fm)(F=66.8，P<0.001)，并且，錳處理對Fv/Fm的影響具有基因型差異(F=7.3，P<0.05)，錳處理和基因型兩因素對Fv/Fm的交互影響顯著(F=7.8，P<0.05)(圖3)。在過量錳處理下，TF210和TF226的Fv/Fm值相對對照分別降低了30.1%和14.8%，并且，在過量錳處理下，基因型TF226的Fv/Fm值顯著高于TF210，TF226的Fv/Fm值是TF210的1.2倍(圖3)。因此，TF226是耐錳基因型，而TF210是錳敏感基因型。

圖2 不同錳處理對柱花草根系生長的影響Fig.2 Effects of different Mn levels on root growth of two stylo genotypes

圖3 不同錳處理對柱花草葉綠素濃度及Fv/Fm的影響Fig.3 Chlorophyll concentration and Fv/Fm in the leaves of two stylo genotypes at different Mn treatments

2.4 不同錳濃度處理對柱花草組織錳含量的影響

過量錳處理顯著增加了柱花草地上部組織錳含量(F=225.9，P<0.001)(圖4)。在過量錳處理下，TF210和TF226地上部錳含量相對對照分別增加了15.7和15.3倍(圖4)。類似的，過量錳處理顯著增加了柱花草根部組織錳含量(F=1963.7，P<0.001)，并且，錳處理對根部組織錳含量的影響具有基因型差異(F=76，P<0.001)，錳處理和基因型兩因素對根部組織錳含量的交互作用顯著(F=40.3，P<0.001)(圖4)。在過量錳處理下，雖然TF210和TF226根部錳含量相對對照分別增加了8.7和10.9倍，但是，基因型TF210的根部錳含量顯著高于TF226，TF210根部錳含量是TF226的 1.4倍(圖4)。此外，在過量錳處理下，TF210和TF226根部錳含量分別是地上部錳含量的1.7和1.5倍(圖4)。

圖4 不同錳處理對柱花草地上部和根部錳含量的影響Fig.4 Mn content in shoots and roots of stylo at different Mn treatments

2.5 不同錳濃度處理對柱花草抗氧化酶活性的影響

從圖5可以看出，不同錳濃度處理影響柱花草葉片抗氧化酶(SOD，POD和CAT)活性，并且，錳處理對抗氧化酶活性的影響具有基因型差異。過量錳(400 μmol·L-1)處理顯著增加了柱花草SOD活性(F=129.7，P<0.001)。相對對照(5 μmol·L-1)處理，TF210和TF226在過量錳處理下的SOD活性分別增加了63.3%和80.5%(圖5)，并且，在過量錳處理下，TF226的SOD活性顯著高于TF210(F=11.1，P<0.05)。

錳處理和基因型兩因素對POD(F=10.6，P<0.05)和CAT(F=7.7，P<0.05)活性的交互影響顯著(圖5)。過量錳處理顯著增加了耐錳基因型TF226的POD和CAT活性(P<0.05)，但對TF210的POD和CAT活性影響不明顯。在過量錳處理下，TF226的POD和CAT活性相對對照分別增加了44.0%和58.6%(圖5)。并且，在過量錳處理下，TF226的POD和CAT活性分別是TF210的1.5和1.3倍(圖5)。

圖5 不同錳處理對柱花草葉片SOD，POD和CAT活性的影響Fig.5 SOD, POD and CAT activities in the leaves of two stylo genotypes at different Mn treatments

3 討論

錳毒害是酸性土壤中限制作物生長和產(chǎn)量的重要因素之一。起源于酸性土壤的植物能夠形成獨特的耐酸錳酸鋁脅迫的機制，從而表現(xiàn)出超強的適應酸性土壤的能力[9]。通過比較分析12種不同豆科植物的耐錳能力，包括大豆(Glycinemax)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、苜蓿(Medicagosativa)和柱花草等，發(fā)現(xiàn)在這些豆科植物中，柱花草具有較強的耐錳能力[11]。在豇豆(Vignaunguiculata)、大麥(Hordeumvulgare)和大豆中，50 μmol·L-1錳濃度處理會導致葉片形成褐色錳斑點的錳毒害癥狀，并抑制了植物的生長[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，柱花草在低于200 μmol·L-1的錳濃度處理下并沒有出現(xiàn)錳毒害的癥狀，只有在400 μmol·L-1的錳濃度處理下才顯著降低了柱花草錳敏感基因型TPCR2001-1葉片的葉綠素濃度和植株干重，說明柱花草錳毒害表現(xiàn)出基因型差異[10]。因此，本研究以2份柱花草基因型(TF210和TF226)為材料，分析過量錳(400 μmol·L-1)處理對苗期柱花草生長的影響及其可能的耐錳機制。

在水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)和大麥等植物中，錳毒害所產(chǎn)生的氧化脅迫破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)、影響光合作用的電子傳遞過程，進而抑制植物的生長，而耐錳的植物或基因型則表現(xiàn)出能夠維持較強的光合作用和植株生長能力[14-16]。在本研究中，過量錳處理顯著抑制了柱花草基因型TF210的地上部和根部干重以及根系生長，降低了TF210葉片SPAD和Fv/Fm值，但對基因型TF226生長影響不明顯(圖1～3)，說明TF226為耐錳基因型，而TF210為錳敏感基因型。值得注意的是，過量錳處理顯著抑制了柱花草基因型TF210的主根長和總根長，但對TF226根系生長影響不明顯(圖2)。類似的，過量錳處理會顯著抑制大豆、水稻和小麥根系的生長[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，在過量錳處理下，小麥根系可以通過調(diào)節(jié)其他礦質(zhì)元素(如鎂、鈣、鐵和磷等)的吸收和分布，從而影響小麥的耐錳能力[16]。因此，在過量錳處理下，通過維持根系的正常生長，可能有助于TF226根系對其他養(yǎng)分的吸收和運輸，從而緩解TF226錳毒害。

在本研究中，盡管過量錳處理顯著增加了柱花草組織錳含量，但耐錳基因型TF226地上部和根部的錳含量顯著低于TF210(圖4)，這與Chen等[10]研究結(jié)果相似，說明降低組織錳的積累可能是TF226耐錳的機制之一。另一方面，在過量錳處理下，雖然TF226地上部和根部錳含量顯著低于TF210，且未表現(xiàn)出錳抑制生長的明顯癥狀，但是過量錳處理仍然顯著增加了TF226地上部和根部的錳含量(圖4)。研究發(fā)現(xiàn)，在一些植物中，細胞中累積的錳，可能被有機酸等螯合并儲存在液泡中[18-20]。例如，在豇豆中，植株內(nèi)部80%的錳離子可以被檸檬酸所螯合[21]。研究發(fā)現(xiàn)，過量錳處理顯著增加了柱花草耐錳基因型Fine-stem葉片和根部的內(nèi)源蘋果酸濃度，增加合成的蘋果酸可能進一步形成錳-蘋果酸復合物，從而緩解了錳毒害[10]。因此，柱花草基因型TF226組織中的錳離子可能被某些物質(zhì)螯合(如有機酸)，并隔離在液泡中，從而未表現(xiàn)出錳毒害的癥狀。

在柱花草中，組織中錳離子的過量積累，會產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)造成氧化脅迫，破壞細胞內(nèi)多種重要代謝酶的活性，從而抑制葉片光合作用，進而影響了柱花草植株和根系的生長。為了適應錳毒害，植物可以通過增強抗氧化能力(抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量)提高抵抗錳毒害的能力[13,15,22]。研究發(fā)現(xiàn)，在過量錳誘導的氧化脅迫下，水稻幼苗可以通過增強SOD，CAT和APX(抗壞血酸過氧化物酶)等酶活性，清除組織內(nèi)積累的活性氧自由基，從而緩解錳毒害[15]。并且，在錳毒害下，增強POD活性及其蛋白表達，被認為是豇豆響應錳毒害的重要機制[22]。在本研究中，過量錳處理顯著增加了耐錳基因型TF226葉片SOD，POD和CAT活性(圖5)，這些抗氧化酶活性的增加，可能在降低由錳毒害造成的氧化脅迫中起重要作用，從而增強了TF226耐錳能力。

4 結(jié)論

綜上所述，在柱花草中，錳毒害下過量積累錳離子，會對細胞產(chǎn)生氧化脅迫，破壞葉綠素合成及光合作用，進而抑制柱花草植株生長。相對柱花草基因型TF210，TF226具有較強的耐錳能力，是耐錳基因型。在錳毒害下，基因型TF226可能通過減少錳的積累并提高抗氧化酶活性，降低由錳毒害造成的氧化脅迫傷害，從而保持較高的葉綠素濃度和最大光化學效率，進而維持了地上部和根系的生長。本研究結(jié)果為探索柱花草耐錳機理及耐錳柱花草品種改良提供了理論依據(jù)及種質(zhì)材料。