張芷毓，歐德瓊，鄔明麗，樊英智，高源，李世鵬，賴振雨，雷初朝，黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100)

TRAF6(TNF receptor associated factor 6)基因，是腫瘤壞死因子超家族(TNF)、Toll樣受體家族(TRLs)和白細(xì)胞介素1受體超家族(TIR)信號(hào)通路調(diào)控途徑中關(guān)鍵接頭分子，是天然免疫信號(hào)通路的重要接頭分子[1]。與此基因相關(guān)的功能包括功能性破骨細(xì)胞的形成與分化，和骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲，一些研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)該基因?qū)π∈蟮某錾昂统錾蟠婊盥实闹匾绊?，在TRAF6基因中誘導(dǎo)突變時(shí)，突變純合的小鼠在出生時(shí)表型正常，但卻過(guò)早地死于骨硬化，少數(shù)存活動(dòng)物的體重也比健康動(dòng)物減少20%～30%，體長(zhǎng)也較短。這一證據(jù)表明，TRAF6基因可以參與牛早期發(fā)育階段的調(diào)節(jié)，因此可以對(duì)牛的性狀產(chǎn)生影響。位于該區(qū)域的數(shù)量性狀位點(diǎn)與荷斯坦牛的產(chǎn)犢和Balman牛的日增重(ADG)相關(guān)[3]。

已知TRAF6基因可以在多種動(dòng)物的多種類型細(xì)胞中表達(dá)，TRAF6的表達(dá)產(chǎn)物，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，是天然免疫信號(hào)通路中重要的接頭分子。研究表明，人和模式生物小鼠等動(dòng)物的TRAF6可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)通路[4-5]。在免疫應(yīng)答，炎癥反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞分化與凋亡等生物學(xué)過(guò)程中起著重要作用[6-8]。目前對(duì)TRAF6的功能研究多見(jiàn)于人，小鼠，家禽及水生動(dòng)物，這些研究表明TRAF6除具有抗病毒功能之外，可能還參與針對(duì)多種類型疾病的免疫應(yīng)答，其中某些突變型還與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)有關(guān)[9]。牛TRAF6基因位于15號(hào)染色體上，含有七個(gè)外顯子，編碼902個(gè)氨基酸，目前關(guān)于牛TRAF6基因多態(tài)性及抗病毒活性的研究主要集中在國(guó)外具有代表性的牛品種上。目前，對(duì)于TRAF6基因在各種動(dòng)物中發(fā)揮的各種不同功能的研究尚在不斷進(jìn)行中，例如是否對(duì)豬的偽狂犬病病毒存在抑制效應(yīng)等[2]。本試驗(yàn)旨在通過(guò)分析陜西地區(qū)秦川牛TRAF6基因的多態(tài)性，為下一步調(diào)查其多態(tài)性與牛體尺的關(guān)聯(lián)性奠定基礎(chǔ)，也為將來(lái)TRAF6基因在肉?？共∮N中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣的采集 從陜西省秦川牛場(chǎng)、陜西省秦川牛良種繁育中心隨機(jī)選取年齡、胎次及產(chǎn)犢時(shí)間相近；放牧、飼養(yǎng)和管理?xiàng)l件相同的健康秦川牛254頭，從牛頸靜脈采血20～40 mL/頭，加ACD抗凝劑2 mL(V(ACD):V(血液)=1:6)，置于冰壺中帶回，-80℃保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 蛋白酶K購(gòu)自德國(guó)默克公司；含染料Reaction MIX、DNA Marker、去離子水；Tris飽和酚、EDTA、Tris、甲醛、硼酸、丙烯酰胺、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)、過(guò)硫酸銨、Temed、二甲基亞砜(DMSO)、N,N,N,N-四甲基乙二胺；十二烷基磺酸鈉(SDS)、去離子甲酰胺、瓊脂粉；HincⅡ酶。

紫外分光光度計(jì)、冷凍高速離心機(jī)(CENTURION，英國(guó))、PCR儀、電泳槽、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、脫色搖床、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2 秦川牛體尺及肉質(zhì)性狀的測(cè)量

實(shí)地測(cè)量所采血樣秦川牛生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)(體高、胸圍、胸寬、胸深、腰高、體重、十字部高、體斜長(zhǎng)、臂長(zhǎng)、腰角寬、腹圍)。

1.3 秦川?；蚪MDNA的提取

采用傳統(tǒng)的酚氯仿抽取法提取秦川牛的基因組DNA，提取后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品的濃度，檢測(cè)完畢后，取一定量的DNA樣品稀釋至50 ng/μL，保存于﹣20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 秦川牛TRAF6基因的PCR-RFLP分析

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank提供的牛TRAF6基因序列(NC_007313)，利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工Sangon Biotech公司提供，引物信息見(jiàn)表1。

表1 牛TRAF6基因的引物信息

1.4.2 TRAF6基因的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系12.5 μL：6.25 μL康維Mix(包括PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑、Mg2+、dNTPs、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer)，4.75 μL ddH2O，0.5 μL上游引物F，0.5 μL下游引物R，0.5 μL DNA(50 ng·μL-1)。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳30 min檢測(cè)。

1.4.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序 隨機(jī)選取30個(gè)秦川牛DNA樣本，每個(gè)樣本取樣2 μL，用移液器輕輕吸打混合均勻，構(gòu)建DNA混池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25 μL：12.5 μL康維Mix(包括PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑、Mg2+、dNTPs、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer)，9.5 μL ddH2O，1μL上游引物F，1 μL下游引物R，1 μL DNA(50 ng·μL-1)。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用SeqMan進(jìn)行對(duì)比尋找突變位點(diǎn)。

1.4.4 PCR產(chǎn)物酶切及PCR-RFLP檢測(cè) 酶切體系10.1 μL:TRAF6基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL、10×Buffer 1 μL、ddH2O 4 μL、限制性核酸內(nèi)切酶HincⅡ0.1 μL。該酶切反應(yīng)體系在37℃恒溫箱中酶切4 h。取酶切產(chǎn)物2.5 μL，12%聚丙烯酰胺凝膠在 120 V電泳1.5 h。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

ym=μ+Markerm+em

式中，ym為個(gè)體表型值，μ為群體均值，Markerm是標(biāo)記基因型效應(yīng)，em為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用合成引物擴(kuò)增樣本牛TRAF6基因突變區(qū)域，所得PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳30min檢測(cè)。如圖1顯示，擴(kuò)增片段與目的片段一致，且條帶清晰、特異性好，可直接用于后期的DNA測(cè)序。

圖1 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 秦川牛TRAF6基因的測(cè)序及測(cè)序結(jié)果分析

使用SeqMan軟件，分析秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域的測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。對(duì)比分析結(jié)果表明：第六內(nèi)含子17628 bp處發(fā)生由T到C的突變，將其命名為T17628C(B)。分析表明，B位點(diǎn)存在2種基因型TT和TC。由于該處突變發(fā)生在TRAF6基因的第六內(nèi)含子區(qū)域，故未引起相應(yīng)氨基酸的突變。

TC型

2.3 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域PCR-RFLP分析

PCR-RFLP分析結(jié)果表明，秦川牛TRAF6基因第六內(nèi)含子區(qū)域存在TT、TC兩種基因型，如圖3顯示，序列經(jīng)酶切后應(yīng)存在三條條帶，但因?yàn)槠渲幸粭l帶較短只有38 bp，故電泳圖譜上僅能體現(xiàn)其中較長(zhǎng)的兩條。HincⅡ酶切位點(diǎn)如圖4顯示。

圖3 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域PCR-RFLP電泳圖

圖4 HincⅡ酶切位點(diǎn)

2.4 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域遺傳多樣性分析

如表2顯示，從群體遺傳學(xué)角度分析秦川牛TRAF6基因各突變位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量等遺傳指標(biāo)。χ2結(jié)果表明，B位點(diǎn) TT是優(yōu)勢(shì)基因型，T為優(yōu)勢(shì)等位基因，位點(diǎn)處于低度多態(tài)狀態(tài)。檢驗(yàn)表明，P﹥0.05，B位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 秦川牛TRAF6基因B位點(diǎn)突變的遺傳多樣性

注：括號(hào)中的數(shù)據(jù)表示檢測(cè)個(gè)體數(shù)。

2.5 秦川牛TRAF6基因突變位點(diǎn)不同基因型與體尺的關(guān)聯(lián)性分析

如表3顯示，運(yùn)用SPSS(22.0)軟件分析169頭秦川牛不同基因型與體高、胸圍、胸寬、胸深、腰高、體重、十字部高、體斜長(zhǎng)、臂長(zhǎng)、腰角寬、腹圍的相關(guān)性。

由表3可知，TRAF6基因B位點(diǎn)不同基因型在體高、胸圍、胸寬、腰高、體重、十字部高、體斜長(zhǎng)、臂長(zhǎng)、腰角寬、腹圍方面無(wú)顯著性差異，TT基因型的個(gè)體均值均高于TC基因型的個(gè)體均值，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。T檢驗(yàn)結(jié)果顯示B位點(diǎn)不同基因型在腰高、十字部高、體斜長(zhǎng)的P值分別為0.066、0.077、0.063，均大于0.05，在一般公認(rèn)的統(tǒng)計(jì)意義上不顯著，但非常接近顯著。

表3 秦川牛TRAF6基因各突變位點(diǎn)不同基因型與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性分析

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

3.討論

TRAF6基因不僅存在于脊椎動(dòng)物中，比如豬牛等禽畜，也存在于許多非脊椎動(dòng)物如青蛤[12]中，以及半滑舌鰨等魚(yú)類[2.11]。說(shuō)明TRAF6基因分布廣泛，對(duì)機(jī)體生存具有重要作用。目前對(duì)于TRAF6基因的研究主要集中在其表達(dá)情況對(duì)于人類疾病的影響，關(guān)于其對(duì)禽畜健康及生長(zhǎng)性能的影響的研究報(bào)道較少，且集中在對(duì)其編碼區(qū)的克隆及序列分析工作，及其對(duì)密碼子使用的偏好分析等工作上。已知牛TRAF6基因分別含有7個(gè)外顯子與6個(gè)內(nèi)含子，而人TRAF6基因有 2 個(gè)轉(zhuǎn)錄突變體(NM_145803.2)(NM_004620.3)與基因組DNA(NC_000011.10)發(fā)現(xiàn)所對(duì)應(yīng)的 DNA分別含有 8個(gè)外顯子和 7個(gè)內(nèi)含子，可見(jiàn)牛和人TRAF6基因的基因結(jié)構(gòu)存在較大差異，不可一概而論[4.8]。

針對(duì)TRAF6基因外顯子設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)PCR-RFLP檢測(cè)分析，均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，而擴(kuò)增TRAF6基因內(nèi)含子的TRAF6-4擴(kuò)增片段在第6內(nèi)含子17628bp處檢測(cè)到T→C突變，可分為TT、TC兩種基因型。該TRAF6基因多態(tài)性位點(diǎn)處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，說(shuō)明該群體在環(huán)境選擇、人工選育等因素的影響下，其遺傳結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變，處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

本研究運(yùn)用PCR-RELP方法，首次對(duì)秦川牛5’調(diào)控區(qū)，CDS區(qū)及部分突變頻率高的內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行SNP篩查，利用PCR-RFLP技術(shù)在突變位點(diǎn)附近發(fā)現(xiàn)HincⅡ-RFLP酶切位點(diǎn)，使用HincⅡ酶對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行切割，當(dāng)此位點(diǎn)的T突變?yōu)镃時(shí)可被HincⅡ酶切開(kāi)，利用電泳技術(shù)可進(jìn)行分型。突變位點(diǎn)多態(tài)性較豐富，關(guān)聯(lián)分析顯示該位點(diǎn)的雜合突變對(duì)牛體尺及體重等生長(zhǎng)性狀存在影響，因此可以作為遺傳標(biāo)記輔助選擇的參考。

4 結(jié)論

陜西地區(qū)秦川牛的TRAF6基因存在較豐富的遺傳多態(tài)性，在第六內(nèi)含子17628 bp處檢測(cè)到了SNP位點(diǎn)，形成兩種基因型，可能作為一種遺傳標(biāo)記作為輔助選擇的參考，對(duì)指導(dǎo)肉牛的育種工作具有實(shí)踐意義。