郭 雁,明 亮,伊 麗,伊日貴,高婉婷,吉日木圖,2,*

(1.內蒙古農業(yè)大學,乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018; 2.內蒙古駱駝研究院,內蒙古阿拉善 750306)

內蒙古優(yōu)越的氣候地貌和植物資源為我國特有種群雙峰駝提供了良好的生存環(huán)境和條件。與其他畜牧牲畜相比,雙峰駝具有極高的農業(yè)和食品經濟價值。雙峰駝駝乳作為荒漠、半荒漠地區(qū)的重要奶源之一,營養(yǎng)豐富,易于消化吸收,且乳中蛋白組分具有很好的生物醫(yī)藥應用前景[1-5]。

血清白蛋白(Serum albumin,SA)是乳中重要的蛋白組分,含量為(8.5±3.58) mg/mL,其分子量相對較大,大約為70 kDa并帶有負電荷[6-8]。SA通常由肝臟合成,在動物體內參與運輸脂肪酸、類固醇激素、氨基酸以及膽色素等物質。SA含有多個配體結構域,能夠與代謝物、維生素、金屬離子及藥物等結合,在血液循環(huán)中可作為許多內源性和外源性物質的存儲和轉運載體。血管內的SA在維持血漿膠體滲透壓方面也起到重要作用,可調節(jié)機體的水電平衡和酸堿平衡[9-11]。

目前對SA的研究主要集中在單峰駝[12-13]及異源動物上[14-15],如牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA),對雙峰駝血清白蛋白(Camel serum albumin,CSA)特別是雙峰駝駝乳中CSA的研究相當匱乏。因此本研究擬從雙峰駝駝乳中分離CSA,并對其氨基酸序列、分子量、等電點、氨基酸組成及二級結構進行分析,旨在綜合開發(fā)利用雙峰駝駝乳及雙峰駝駝乳蛋白,并為探究CSA與其他動物SA的差異與優(yōu)勢奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

駝乳 內蒙古阿拉善盟健康雙峰母駝6峰,分別擠奶后混合乳樣,采集后置于-80 ℃保存;預染蛋白Marker(10～170 kDa) 美國Thermo Fisher Scientific公司;SDS-PAGE預制膠(15%分離膠、5%濃縮膠) 江蘇南京金斯瑞生物科技有限公司;等點聚焦標準物 美國GE公司;兩性電解質 美國Bio-Lyte;二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;異硫氰酸苯酯(PITC)、乙腈 美國Sigma公司;所有試劑 均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 駝乳預處理 駝乳在4 ℃下解凍。解凍后于4 ℃,5000 r/min,離心30 min。棄去上層脂肪,即得脫脂乳。脫脂乳在室溫下用1 mol/L的HCl溶液調至pH為4.3,40 ℃水浴20 min,8000 r/min離心20 min(4 ℃),收集上清液(乳清)[16-17]。將收集的上清液用0.22 μm針頭濾器過濾,-20 ℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.2 離子交換層析分離CSA 采用DEAE-FF層析柱(16 mm×25 mm),用20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.4)平衡層析柱直至紫外吸收基線、電導穩(wěn)定[18]。將過濾后的乳清蛋白樣液加入DEAE-FF層析柱,用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4)洗脫。待紫外(UV)值較穩(wěn)定,用含0.1～0.4 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.4)進行線性洗脫[19]。洗脫速度60 mL/h,280 nm下自動檢測并記錄。收集洗脫峰,-20 ℃保存?zhèn)溆茫珺SA標準品為對照。

1.2.3 凝膠層析純化CSA Sephacryl S-100層析柱(16 mm×60 mm)用20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.4)平衡至基線穩(wěn)定。將DEAE-FF層析柱收集的洗脫液上樣進行二次純化。洗脫速度30 mL/h,280 nm下自動檢測并記錄,收集洗脫峰,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 CSA純度的鑒定 采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法。將層析收集所得的蛋白質洗脫峰,用SDS-PAGE凝膠電泳對所純化蛋白組分進行鑒定[20-21]。所用分離膠濃度為15%,濃縮膠濃度為5%。起始恒定電壓為90 V,時間約為30 min。進入分離膠后,恒定電壓120 V,時間約2 h。當染料(溴酚藍)距底邊1 cm時,停止電泳。經考馬斯亮藍染色,脫色液脫色,將凝膠放入凝膠成像儀中成像。

1.2.5 氨基酸序列覆蓋率分析 參考Nagarj等[22]和Thakur[23]的方法,將純化后CSA經胰酶酶解后,采用高相液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)對CSA進行氨基酸序列分析。通過質譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索實現(xiàn)對CSA的鑒定。

1.2.6 CSA結構表征

1.2.6.1 CSA分子量的測定 采用液質聯(lián)用LC-MS高分辨質譜對CSA的相對分子量進行分析[24-25]。將一定量CSA加入0.1%甲酸水中,調節(jié)pH至2～3之間,離心(3000 r/min,10 min)取上清;用BCA試劑盒以BSA為標準品測定上清中蛋白濃度,并用0.1%甲酸水稀釋樣品濃度至0.1 μg/μL進行上機檢測。

高效液相色譜條件:色譜柱為MAbPac RP,Analytical(0.3 mm×150 mm),采用0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)流動體系,分析時間為20 min,流速200 μL/min,梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質譜條件:采用IDA采集模式,一個MS1圖譜選擇40個最強的母離子進行串級掃描,質譜掃描范圍800～4000 m/z。

1.2.6.2 CSA等電點的測定 參照楊宇峰等[26]的方法,采用等電聚焦電泳法測定樣品的等電點。將一定量CSA進行超濾脫鹽處理,隨后選用適當?shù)某瑸V管超濾濃縮,再以1%甘氨酸進行置換超濾清洗。將置換后樣品和對應的標準品至上樣孔,按照電壓500 V,電流50 mA,功率為每1 cm凝膠1 W的電泳條件,電泳20 min,之后設置電壓2000 V,電流50 mA,功率為每1 cm凝膠1 W,再電泳90 min后停止。經染色,脫色后轉移至掃描儀進行圖像掃描,并用Image Quant TL Version 7.0軟件分析樣品的等電點。

1.2.6.3 CSA氨基酸組成分析 通過異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法測定CSA水解物中游離氨基酸以確定氨基酸組成[27]。

將CSA在6 mol/L HCl條件下水解成游離氨基酸,然后用PITC對游離氨基酸進行衍生化處理,處理完畢后,以18種氨基酸為標準品,在同等高效液相色譜條件下，對衍生化的氨基酸樣品對應的保留時間進行分析,并計算各氨基酸的含量。

高效液相色譜條件:流動相A液為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液,B液為甲醇乙腈水溶液(甲醇∶乙腈∶水=20∶60∶20(V∶V∶V)),流速1.0 mL/min,柱溫35 ℃。色譜柱以95%的A液平衡后,樣品由自動進樣器上樣到氨基酸分析柱Diamonsi AAA(250 mm×4.6 mm)。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.2.6.4 CSA圓二色譜分析 將純化的CSA溶液置于超濾管中,利用反復濃縮的方法使20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.4)替換為20 mmol/L PB緩沖液(pH8.0)。根據(jù)儀器響應水平將蛋白質量濃度濃縮為0.2 mg/mL,以20 mmol/L PB緩沖液(pH8.0)作為空白對照[28-29]。

圓二色譜條件:波長掃描范圍為190～250 nm,步長1.0 nm,掃描速度50 nm/min,檢測環(huán)境為室溫。掃描后圓二色譜圖利用Jwstda32軟件對樣品二級結構進行擬合計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件分析,結果表示為平均值±標準差(S)的形式,n=3。

2 結果與分析

2.1 駝乳乳清蛋白陰離子柱層析分離

駝乳乳清蛋白的DEAE-FF離子交換層析洗脫曲線見圖1。由圖1可知,在280 nm紫外檢測儀在線檢測條件下得到5個洗脫峰,其中用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4)洗脫得到3個洗脫峰,即峰Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ;待UV值較穩(wěn)定后,采用含有0.1～0.4 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4)進行線性洗脫得2個洗脫峰,即峰Ⅳ,Ⅴ。收集上述洗脫峰并通過SDS-PAGE凝膠電泳，對DEAE-FF離子交換層析所得的蛋白組分進行分析,結果如圖2所示,以BSA為標準品進行對照可知,洗脫峰Ⅴ中有目的蛋白CSA被洗脫出,該洗脫峰所對應的NaCl濃度為0.24 mol/L左右。由于SDS-PAGE凝膠圖(圖2)中蛋白條帶Ⅴ中還存在多條雜蛋白帶,因此需對該峰的洗脫液進行二次純化。

圖1 乳清蛋白的DEAE-FF離子交換層析圖Fig.1 DEAE-FF chromatographic fractionation of camel’s milk whey

圖2 駝乳乳清蛋白離子交換層析后 各收集峰的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoretic analysis of the purified camel whey proteins 注:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ和Ⅴ表示分別對應圖譜中的洗脫峰Ⅰ～Ⅴ； M表示蛋白質分子質量標準(15～170 kDa)。

2.2 凝膠層析純化結果與分析

對離子交換柱分離所得的含有CSA的洗脫峰Ⅴ,用聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl S-100進行進一步純化,經Sephacryl S-100柱層析分離純化后,其層析圖譜見3。由圖3可知,洗脫峰Ⅴ經Sephacryl S-100純化后,獲得2個洗脫峰(Ⅰ和Ⅱ)。收集上述洗脫峰并通過SDS-PAGE凝膠電泳進行組分分析及純度鑒定,結果如圖4所示,Sephacryl S-100層析洗脫峰Ⅱ對應的SDS-PAGE凝膠電泳蛋白條帶分子量約為70 kDa,且該蛋白條帶明顯且單一,基本無雜蛋白,因此可初步確認該組分為目的蛋白CSA,且純化效果較好。通過蛋白凝膠圖對樣品的純度進行分析可知,經二次純化后目的蛋白CSA純度在95%以上,純度結果表明本試驗所采用的方法是有效的,可行的。此外,在分離過程中緩沖液鹽濃度較低,從而避免了蛋白質的變性降解,保證了CSA后續(xù)結構表征的分析研究。

圖3 Sephacryl S-100凝膠層析純化圖Fig.3 Sephacryl S-100 gel chromatographic fractionation

圖4 Sephacryl S-100凝膠柱層析 收集峰的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoretic analysis of the purified CSA.注:M表示蛋白質分子質量標準(15～170 kDa), Ⅱ對應Sephacryl S-100層析圖譜中洗脫峰Ⅱ。

2.3 氨基酸序列分析

LC-MS/MS檢測結果如圖5所示,其中黑色粗體標記的序列為實際檢測到的肽斷。經NCBI數(shù)據(jù)庫檢索分析表明，樣品CSA的氨基酸序列與野駱駝的氨基酸序列(NCBI:XP_006188754)有較高的相似度,蛋白氨基酸覆蓋率為89%,兩者具有同源性。該結果說明純化蛋白為目標蛋白CSA,滿足后續(xù)試驗要求。

圖5 CSA/NCBI數(shù)據(jù)庫XP_006188754序列覆蓋度圖 Fig.5 Database amino acid sequence of CSA(NCBI accession no. XP_006188754)was compared with the purified protein注:Carbamidomethylation表示半胱氨酸殘基的固定修飾物,Oxidation為被氧化的蛋氨酸。

2.4 CSA分子質量的確定

通過LC-MS質譜對提純后CSA進行分析,可得該樣品溶液的總離子流色譜圖(圖6)及質譜圖(圖7)。其中總離子流色譜圖僅有1個主峰,其保留時間為9.246 min;其余色譜峰由于在樣品溶液中濃度較低其峰不明顯,如:保留時間為0.542、2.983、5.318 min所對應的色譜峰。

圖6 CSA溶液總離子流圖(TIC)Fig.6 Total ion chromatography of CSA in camel milk

圖7 CSA溶液質譜圖Fig.7 Mass spectrum diagram of CSA solution

利用色譜圖面積歸一化法定量分析,可知CSA所對應的色譜峰即為圖6中的主峰。因此選取保留時間在9.236 min時的質譜圖(圖6)為研究對象,通過Bio Pharma Finder 2.0軟件將質譜圖(圖7)中多電荷峰解卷積,得到解卷積譜圖(圖8),分析計算得CSA分子量為66490.17 Da。該分子量與之前報道的單峰駝CSA、BSA和HSA分子量基本保持一致[12,30-31]。

圖8 CSA溶液質譜解卷積圖Fig.8 Deconvolution diagram of CSA solution

2.5 CSA等電點的確定

通過等電聚焦電泳法對CSA等電點進行分析,CSA和等電點標準品等電聚焦電泳圖如圖9所示。將掃描后膠圖(圖9)采用Image Quant TL Version 7.0軟件分析CSA的等電點,計算得CSA等電點pI為4.48。這與已報道的BSA等電點4.70,HSA等電點4.90相近[32-33]。

圖9 駝乳中CSA等電聚焦電泳圖Fig.9 IEF of CSA in camel milk注:M-pI表示IEF等電點標準(4.45～9.6 kDa)。

由于蛋白質是由氨基酸組成的,因而蛋白質分子所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數(shù)目直接影響其在溶液中所帶的電荷,即影響其等電點[34-35]。根據(jù)上述計算結果可知CSA等電點偏酸性,因此CSA蛋白質分子中含有較多酸性氨基酸。

2.6 CSA氨基酸組成分析

本文采用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法對CSA氨基酸組成進行研究。樣品CSA水解后的游離氨基酸樣品經PITC衍生化處理后,經過高效液相色譜LC-20AT設備分析,得到的圖譜經Labsolution軟件積分標峰,所得的標峰圖譜見圖10,數(shù)據(jù)處理積分結果見表3。從表3可知,CSA氨基酸除色氨酸(Trp)外,富含17種氨基酸,其中人體必需氨基酸占氨基酸總量的47.36%;氨基酸組成中含量最高的是谷氨酸(Glu),占總氨基酸含量的12.41%,其次是亮氨酸(Leu)占總量的12.3%。由于實驗前對CSA進行酸水解處理,天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)分別轉化為天冬氨酸(Asp)和谷氨酸,故將前者與后者理論個數(shù)合并計算;色氨酸在酸水解過程中吲哚環(huán)被破壞,因此表3中色氨酸含量無相應數(shù)據(jù)提供。

表3 駝乳中CSA氨基酸組成含量Table 3 Amino acid composition of CSA in camel milk

圖10 駝乳中CSA氨基酸組成液相色譜圖譜Fig.10 HPLC chromatogram of amino acid composition of CSA in camel milk

參考孫軍勇[36]的報道可知，谷氨酸和天冬氨酸的流水值為零，屬于親水性氨基酸。絲氨酸疏水值為-0.3，是親水性最強的氨基酸。由表3可得，CSA中疏水性氨基酸含量較高，占總量的71.64%。

為了進一步分析CSA的營養(yǎng)價值,依據(jù)FAO/WHO/UNO人體必需氨基酸推薦值,從表3可以看出,CSA所含有的必需氨基酸含量均能夠滿足成人需求,而含硫氨酸(蛋氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)含量不能滿足兒童的需求,這可能與蛋氨酸或半胱氨酸在酸性條件下易損失相關。

2.7 CSA的圓二色譜分析

圓二色譜(CD譜)在遠紫外區(qū)(185～245 nm)的掃描圖譜,反映的是蛋白質主鏈的構象。計算所得的是蛋白質二級結構比例,即α-螺旋(α-helix)、β-折疊(beta-sheet)、轉角(turn)和不規(guī)則卷曲(random coil)的比例。其中α-螺旋在192 nm附近有1個正峰,在207～210和221～222 nm處有2個負峰;β-折疊在185～200 nm附近有1個正峰,在217～218 nm附近有1個負峰;β-轉角的極值波長在205 nm附近有1個正峰,在220～230 nm附近有1個弱信號負峰,在180～190 nm附近有1個強信號負峰;而無規(guī)卷曲在220 nm附近有1個正峰,在200 nm附近有1個負峰[37]。

CSA在遠紫外區(qū)的圓二色譜圖見圖11。如圖11所示,CSA在192 nm處有1個正峰,在208,222 nm 處呈兩個負的特征肩峰,說明CSA中含有α-螺旋和β-折疊,可見CSA是一種α+β型蛋白。該分析結果與Michael Dockal報道的HSA二級結構型一致[38]?；贑D譜摩爾橢圓率(θ),采用Jwstda32軟件對樣品CSA與軟件自帶的標準二級結構曲線進行擬合計算,得到CSA的二級結構比例。其中α-螺旋所占比例最高為51.1%,其次是不規(guī)則卷曲19.8%和β-轉角14.8%,β-折疊含量最低8.5%。該測定結果不僅補充了對CSA性質研究的空白,也為CSA的分析和鑒定提供了新的光譜鑒定依據(jù)。除此之外,有文獻報道BSA二級結構組成比重中α-螺旋為54.5%[39],HSA中α-螺旋含量為46.6%[40],其中CSA,BSA 所含有的α-螺旋結構明顯高于HSA,因此CSA,BSA主鏈走向(結構)較HSA穩(wěn)定。

圖11 駝乳中CSA的CD圖譜 Fig.11 Circular dichroism spectrum of CSA in camel milk

3 結論

本研究根據(jù)雙峰駝駝乳中CSA的特性,采用離子交換層析,凝膠過濾層析分離純化CSA,并通過SDS-PAGE凝膠電泳,氨基酸序列分析對所純化蛋白質進行純度分析及鑒定。其中SDS-PAGE凝膠電泳經考馬斯亮藍染色后膠圖顯示單一條帶,經分析得該蛋白條帶為目的蛋白CSA且其純度在95%以上,提純效果好,隨后氨基酸序列分析結果顯示,CSA氨基酸序列與野駱駝中CSA的氨基酸序列覆蓋率高達89%,兩者具有同源性,確定純化蛋白為CSA。隨后對CSA的結構進行解析,結果表明,CSA相對分子量為66490.17 Da,等電點為4.48,谷氨酸含量最高(12.41%),是一種營養(yǎng)豐富的優(yōu)質蛋白質。經過圓二色譜測定CSA二級結構,判定其符合α+β型蛋白且在一定條件下結構更穩(wěn)定。