孫文麗,孫 玲,邢 政,侯小珊,何榮海,馬海樂

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

我國是一個(gè)食醋生產(chǎn)和消費(fèi)的大國,食醋作為一種大眾化的調(diào)味品,在日常生活中已必不可缺。目前歐美等大部分國家的食醋釀造主要為液態(tài)深層發(fā)酵工藝,通過以醋酸菌為主的純菌發(fā)酵進(jìn)行,此工藝下食醋有機(jī)酸、風(fēng)味物質(zhì)單一[1]。而我國主要采用的是多菌種固態(tài)發(fā)酵工藝釀醋,其在發(fā)酵過程中存在大量的微生物,它們共同作用使得固態(tài)釀造食醋具有豐富的味覺,其中除了含有大量的有機(jī)酸之外,還含有豐富的氨基酸、揮發(fā)性物質(zhì)等,本質(zhì)上是一個(gè)微生物菌種混合發(fā)酵的過程。鎮(zhèn)江香醋是我國比較有代表性的固態(tài)發(fā)酵食醋[2-4]。

然而固態(tài)發(fā)酵在賦予食醋特有風(fēng)味[5]的同時(shí),易出現(xiàn)食醋返混現(xiàn)象,即在保質(zhì)期內(nèi)會(huì)在瓶底出現(xiàn)沉淀,瓶口出現(xiàn)浮圈等現(xiàn)象。一般食醋在其貨架期內(nèi)(2～3個(gè)月)會(huì)出現(xiàn)不同程度的返混[6],這些現(xiàn)象的出現(xiàn)不僅影響食醋的感官、品質(zhì),也影響食醋生產(chǎn)企業(yè)的效益[7]。目前,固態(tài)發(fā)酵食醋的返混機(jī)理主要?dú)w結(jié)為非生物性返混和生物性返混[8-9]。非生物性返混常與原料大分子的分解程度、單寧分子、金屬離子和氧化酶等因素有關(guān)[10]。對(duì)于非生物性返混,段連華等[11]、López等[12]已進(jìn)行相關(guān)研究進(jìn)行改善,選擇合適的澄清劑[13]也可以達(dá)到一定澄清的效果。而引起食醋生物性返混的主要原因則是雜菌污染,導(dǎo)致食醋雜菌污染的原因主要有以下幾點(diǎn):釀造工藝及釀造過程的開放式,造成微生物的復(fù)雜多樣性,已知主要有醋酸菌、霉菌、酵母菌、乳酸菌等[14-15],從而使雜菌易進(jìn)入發(fā)酵體系;原料、容器和管道的滅菌不徹底級(jí)灌裝和存儲(chǔ)過程中的管理不善;食醋中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)也有利于芽孢桿菌產(chǎn)生的耐熱芽孢,且后續(xù)殺菌工藝不能完全殺滅耐熱芽孢[16]。崔云等[17]從成品固態(tài)發(fā)酵食醋中分離出了4種雜菌,分別屬于芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬和葡糖桿菌屬,而周翔等[18]也在某固態(tài)發(fā)酵食醋生產(chǎn)廠中對(duì)問題醋進(jìn)行檢測(cè),也檢出有芽孢桿菌,說明成品食醋的渾濁、變質(zhì)可能是由于芽孢桿菌再次發(fā)酵引起的。林秀敏等[19]則發(fā)現(xiàn)食醋渾濁并非由可培養(yǎng)微生物引起,而可能由非可培養(yǎng)微生物引起的。目前,對(duì)于食醋中微生物雜菌污染問題,報(bào)道結(jié)果并不一致且存在一定的差異;且多數(shù)報(bào)道并無對(duì)污染雜菌進(jìn)行系統(tǒng)的分離鑒定及生理生化特性研究。然而雜菌污染會(huì)對(duì)食醋的感官、體態(tài)、口感、品質(zhì)等造成較大影響,不僅影響產(chǎn)品的質(zhì)量安全,而且還會(huì)對(duì)食醋生產(chǎn)企業(yè)的信譽(yù)和形象帶來損害。因此,對(duì)食醋中的污染雜菌進(jìn)行研究具有重要意義。

針對(duì)目前食醋污染研究不足的問題,本研究主要通過對(duì)比分析正常食醋與脹氣食醋的生理生化指標(biāo),探究污染雜菌對(duì)食醋造成的品質(zhì)影響,對(duì)脹氣食醋中的污染雜菌進(jìn)行系統(tǒng)的分離鑒定及生理生化特性研究,為實(shí)際生產(chǎn)中控制微生物造成食醋污染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正常成品固態(tài)發(fā)酵食醋與脹氣食醋 由某調(diào)味品廠提供;培養(yǎng)基 AAM培養(yǎng)基[20]、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基;生理生化鑒定管 購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 購于康為世紀(jì)公司;API試劑條 購于生物梅里埃公司;硫化氫檢測(cè)管、氨氣檢測(cè)管、氮氧化物檢測(cè)管、二氧化碳檢測(cè)管、手泵 購于上海孟良儀器技術(shù)有限公司;其他化學(xué)藥品 均為分析純產(chǎn)品。

N-300M型光學(xué)顯微鏡 購于南京江南永新光學(xué)有限公司；Waters 1525高效液相色譜 購于美國Waters公司；UV-1601型紫外可見分光光度計(jì) 購于上海光譜儀器有限公司；T100 PCR儀 購于Biometra公司；DYY-7C電泳儀 購于上海六一儀器廠；LRH-250型恒溫培養(yǎng)箱 購于上海恒一科學(xué)儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 購于上海醫(yī)療器械五廠；YX280A型高壓蒸汽滅菌器 購于上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 食醋樣品感官指標(biāo)的對(duì)比 參考GB 18187-2000中的方法,對(duì)正常成品固態(tài)發(fā)酵食醋與脹氣食醋的色澤、香氣、體態(tài)進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.2 食醋樣品基本理化指標(biāo)的測(cè)定 采用pH計(jì)測(cè)定食醋樣品的pH;根據(jù)GB/T 18187-2000對(duì)食醋中可溶性固形物、氯化鈉含量、可溶性無鹽固形物含量進(jìn)行測(cè)定;按GB/T 5009.41-2003對(duì)食醋樣品的總酸度進(jìn)行測(cè)定;依據(jù)GB/T 5009.41-2003測(cè)定食醋樣品中的氨基態(tài)氮含量;根據(jù)文獻(xiàn)[21]對(duì)食醋樣品中的還原糖含量進(jìn)行測(cè)定;利用HPLC法對(duì)食醋樣品中有機(jī)酸含量進(jìn)行的測(cè)定。

1.2.3 脹氣食醋樣品氣體成分分析 用手泵收集脹氣食醋樣品中的氣體,分別用硫化氫檢測(cè)管、氨氣檢測(cè)管、氮氧化物檢測(cè)管、二氧化碳檢測(cè)管檢測(cè)脹桶食醋樣品中硫化氫、氨氣、氮氧化物、二氧化碳4種氣體的濃度,方法參照操作說明書。

1.2.4 菌種的分離、純化 將脹氣食醋逐次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同濃度梯度,用移液槍分別吸取100 μL不同稀釋度的污染醋于AAM、營養(yǎng)肉湯、MRS、YPD培養(yǎng)基上,做3個(gè)平行,同時(shí)用無菌水做空白對(duì)照,于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。挑取可以在培養(yǎng)基上生長的主要菌種的單菌落分別分離純化,對(duì)分離得到的單菌落進(jìn)行簡單的結(jié)晶紫染色[22],在光學(xué)顯微鏡下觀察其純度和形態(tài),不純的用劃線分離法進(jìn)行純化,經(jīng)鏡檢純化的單菌落于4 ℃冰箱中斜面保藏,并于-80 ℃條件下50%甘油保藏。

1.2.5 菌種鑒定 分別對(duì)菌株進(jìn)行菌落形態(tài)及顯微形態(tài)觀察、產(chǎn)氣與耐熱性測(cè)定、生理生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定。

1.2.5.1 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)觀察 將所得到的菌在培養(yǎng)基上涂布,進(jìn)行菌落形態(tài)觀察。選取24 h內(nèi)新鮮菌進(jìn)行革蘭氏染色[22],涂片不宜過厚,以免脫色不完全造成假陽性。乙醇脫色時(shí)間要掌握恰當(dāng),一般以不溶出色素為止。紫色為陽性。

1.2.5.2 產(chǎn)氣與耐熱性測(cè)定 將分離菌用液體培養(yǎng)基于37 ℃活化培養(yǎng)24 h,以4%的接種量接種到糖發(fā)酵培養(yǎng)基中,內(nèi)置有杜氏發(fā)酵管,注意小倒管中不要有氣泡,37 ℃靜置培養(yǎng),觀察杜氏小管中有無氣泡或絮狀物產(chǎn)生。以空白培養(yǎng)基作對(duì)照[16]。將鏡檢已純化的菌株接種于10 mL無菌水中制成菌懸液,于80 ℃水浴中13 min進(jìn)行熱休克處理[23-24],再采用涂布法接種于平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌株的生長狀態(tài),考察其耐熱性。

1.2.5.3 生理生化鑒定 使用生理生化鑒定管和API 50 CHB對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。使用生理生化鑒定管對(duì)菌株進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、明膠液化、吲哚試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定。按照使用說明,利用API 50 CHB鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株對(duì)49種碳源底物的利用能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果分析時(shí),以0號(hào)管為對(duì)照,比0號(hào)管顏色黃的判讀為陽性反應(yīng)(25號(hào)管黑色為陽性反應(yīng)),反之為陰性反應(yīng)。

1.2.5.4 分子生物學(xué)鑒定 a. DNA的提取:將分離菌種接種在液體AAM培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)24 h,用細(xì)菌通用基因組DNA提取試劑盒按步驟提取菌株DNA。

b. PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增的上游引物為27F,下游引物為1541R。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:2×Es Taq MasterMix 12.5 μL,模板DNA 0.5 μL,PrimerF(10 μmol/L)1 μL,PrimerR(10 μmol/L)1 μL,ddH2O 10 μL。

PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán),95 ℃變性0.5 min,55 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸1.5 min,29個(gè)循環(huán),之后72 ℃終延伸10 min,4 ℃保藏。

c. PCR產(chǎn)物檢測(cè):采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。本試驗(yàn)的點(diǎn)樣量為5 μL DNA 樣品+loading buffer(0.25%的溴酚蘭蔗糖水溶液)。同時(shí)在其中一個(gè)膠孔內(nèi)點(diǎn)入5 μL的Marker作為對(duì)照,以便確定DNA片段的大小。

d. DNA序列的測(cè)定:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物寄往北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì),構(gòu)建各菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 生長特性的研究 生長曲線的測(cè)定:將分離得到菌分別接入滅菌的AAM液體培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)。前10 h每小時(shí)取樣一次,之后每2 h取樣一次測(cè)各菌株培養(yǎng)液的吸光值,以未接種的空白AAM液體培養(yǎng)基為參比,利用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光度。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,繪制各菌株在37 ℃下的生長曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

食醋樣品理化指標(biāo)、頂隙氣體成分分析、菌株生理生化等實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,數(shù)值計(jì)算利用Excel軟件進(jìn)行平均值與方差的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 食醋感官指標(biāo)分析

正常食醋與脹氣食醋的感官指標(biāo)對(duì)比分析如表1所示。分析正常食醋和脹氣食醋樣品的感官指標(biāo)發(fā)現(xiàn),脹氣組發(fā)生明顯的脹氣現(xiàn)象,食醋顏色深于正常組,典型的醋香味不明顯,酸味刺鼻且有輕微焦糖味,且脹氣食醋伴隨有較多沉淀現(xiàn)象。

表1 食醋感官指標(biāo)分析Table 1 Analysis of sensory index of vinger

2.2 食醋樣品理化指標(biāo)結(jié)果分析

分別對(duì)正常組和脹氣組樣品的pH、可溶性固形物含量、氯化鈉含量、可溶性無鹽固形物含量、總酸度、還原糖、氨基態(tài)氮含量、有機(jī)酸含量等進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表2。分別以有機(jī)酸的峰面積為縱坐標(biāo),有機(jī)酸含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而建立各有機(jī)酸的回歸方程,結(jié)果見表3,有機(jī)酸含量結(jié)果見表4。由結(jié)果可知脹氣組pH略高于正常組,總固形物含量約為正常組的1.6倍,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組食醋,氯化鈉、還原糖含量兩組差異不大,總酸度脹桶組約為正常組的1.5倍,氨基態(tài)氮含量,脹氣組遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組。這表明,食醋發(fā)生脹氣,其理化性質(zhì)會(huì)發(fā)生一系列改變,這與脹氣食醋中存在的微生物有關(guān)。由有機(jī)酸、糖分及氨基酸等組分對(duì)傳統(tǒng)釀造食醋的味感起主要作用,其中有機(jī)酸是主要的風(fēng)味物質(zhì),有機(jī)酸的種類和含量與食醋的口感及品質(zhì)有緊密聯(lián)系。從結(jié)果來看,正常組和脹氣組食醋的有機(jī)酸構(gòu)成中,乙酸含量均為最高,其次為乳酸。乳酸和乙酸共同構(gòu)成食醋的主體有機(jī)酸,為食醋的主要呈酸物質(zhì)。對(duì)比正常食醋與脹氣食醋中各有機(jī)酸含量發(fā)現(xiàn),脹氣食醋中各有機(jī)酸含量均有不同程度的增長,這主要與脹氣食醋中存在污染微生物有關(guān)。

表2 樣品理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of samples physical and chemical properties

表3 各種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equations and correlation coefficients of organic acids

表4 食醋有機(jī)酸含量(mg/100 mL)Table 4 Content of each organic acid in vinegar samples(mg/100 mL)

2.3 脹氣食醋樣品氣體成分分析

分別用4種檢測(cè)管檢測(cè)脹氣食醋樣品中的氣體成分,結(jié)果見表5。在微生物的生長代謝過程中,可以通過三羧酸循環(huán)、糖代謝等一系列的代謝反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳?xì)怏w,檢測(cè)結(jié)果顯示氨氣、

表5 脹氣食醋成分分析(%)Table 5 Analysis of gas composition in pollution vinegar(%)

氫氣、硫化氫氣體均未檢出,而二氧化碳含量高于1.1%,已知空氣中二氧化碳含量約為0.04%[16],脹氣食醋中二氧化碳濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空氣中濃度,說明脹氣食醋中主要?dú)怏w成分為二氧化碳,由微生物代謝產(chǎn)生。

2.4 污染雜菌的確定

從污染食醋中經(jīng)過分離、篩選、純化,最終在AAM培養(yǎng)基上分離得到2株污染雜菌,即分離菌1號(hào)、4號(hào)。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上得到了4株污染雜菌,即分離菌RT-1、RT-2、RT-3、RT-4。6株菌的形態(tài)描述如表6所示。

表6 菌株形態(tài)學(xué)特征Table 6 Morphological characteristics of strains

2.5 菌種鑒定

2.5.1 分離菌形態(tài)學(xué)鑒定 簡單的革蘭氏染色后,經(jīng)顯微觀察,分離菌的顯微形態(tài)如圖1所示。

圖1 菌株顯微形態(tài)觀察Fig.1 Results of micro-morphology 注:1.1號(hào);2.4號(hào);3.RT-1;4.RT-2;5.RT-3;6.RT-4。

經(jīng)染色觀察發(fā)現(xiàn),6株分離菌均為G+,菌落形態(tài)如圖1所示。其中1號(hào)菌、4號(hào)菌、RT1、RT4經(jīng)芽孢染色[25]后發(fā)現(xiàn)均能夠生成芽孢,具體種屬確定還需要進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

2.5.2 產(chǎn)氣與耐熱性鑒定 將分離菌接種到糖發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后觀察產(chǎn)氣情況,產(chǎn)氣與沉淀情況如表7所示。結(jié)果可知,4號(hào)菌具有產(chǎn)氣能力,其余分離菌均可產(chǎn)生一定量的絮狀物沉淀,其中1號(hào)菌絮狀物沉淀較多,因此對(duì)1號(hào)菌和4號(hào)菌做進(jìn)一步的生理生化鑒定。

表7 食醋產(chǎn)氣與沉淀分析Table 7 Analysis of gas production and precipitation in vinegar

分離菌1號(hào)和4號(hào)經(jīng)過80 ℃、水浴13 min 進(jìn)行熱休克處理后,均可以在AAM培養(yǎng)基上生長,表明在食醋生產(chǎn)最后經(jīng)過高溫濃縮過程依然不能將污染雜菌除去,從而造成食醋的后期污染;另外分離雜菌可以在酸性AAM培養(yǎng)基上生長良好,表明兩株菌均可以在食醋酸性條件下生長良好,酸性環(huán)境并不能對(duì)污染菌造成抑制;以上分析初步確定了分離菌1號(hào)和4號(hào)為食醋中的污染雜菌。

2.5.3 生理生化鑒定 分離菌1號(hào)、4號(hào)的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。結(jié)果表明1號(hào)菌,氧化酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陽性,明膠液化試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)為陰性。4號(hào)菌氧化酶試驗(yàn)、VP試驗(yàn)為陽性,接觸酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)為陰性。分離菌1號(hào)和4號(hào)的碳源利用情況如表9所示,結(jié)果顯示,1號(hào)菌和4號(hào)菌的碳源利用情況一致。鑒定結(jié)果與試劑盒提供的芽孢桿菌屬的糖利用情況基本一致,其中僅10半乳糖、17肌醇、19山梨醇、33菊糖利用不同,剩余45種糖的利用情況完全一致。初步猜測(cè)這種差異應(yīng)該是同菌屬不同菌種之間表現(xiàn)出來的差異性,初步推測(cè)這兩株菌為芽孢桿菌屬,具體種還需要進(jìn)一步鑒定。

表8 各菌株生理生化反應(yīng)分析Table 8 Results of physiological characteristics

表9 各菌株碳源利用特征Table 9 Carbon source utilization characteristics of each strain

2.5.4 PCR產(chǎn)物電泳圖 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化的電泳圖如圖2所示。

圖2 1號(hào)、4號(hào)、RT1、RT2、RT3、 RT4 DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR products electrophoresis of No.1,No.4,RT1,RT2,RT3,RT4

由圖2可知，6株菌的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，條帶大小約在1500 bp左右，且均只有一條亮帶，說明基因擴(kuò)增成功。

2.5.5 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 分別對(duì)6株分離菌構(gòu)建菌株發(fā)育樹,如圖3所示。16S rDNA測(cè)序分析結(jié)果可知,6株菌1號(hào)、4號(hào)、RT1、RT2、RT3、RT3、RT4分別與Bacillusvelezensis、Bacillustequilensis、Bacillusvelezensis、Staphylococcussaprophyticus、Staphylococcuscapitis、Bacillusstubtilis的相似度均達(dá)到98%及以上。因此,初步認(rèn)為分離菌1號(hào)、RT1為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis),4號(hào)菌為特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis),RT2為腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、RT3為頭狀葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)、RT4為枯草芽孢桿菌(Bacillusstubtilis)。

2.6 生長特性研究結(jié)果

分離菌1號(hào)菌和4號(hào)菌的生長曲線如圖4所示。從圖中可以看出,1號(hào)菌的遲緩期較短,約從第2 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期,第9 h OD值達(dá)到最高,之后OD值下降約從第11 h進(jìn)入穩(wěn)定期。4號(hào)菌約從第3 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期,菌體濃度在第7 h達(dá)到最大值,之后OD值下降,從第11 h進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖4 分離菌的生長曲線Fig.4 Growth curve of isolated strain

3 結(jié)論

通過分析正常食醋與脹桶食醋樣品的理化性質(zhì),可知脹氣食醋中總酸、可溶性無鹽固形物含量、氨基酸態(tài)氮含量升高;各有機(jī)酸含量明顯升高;且脹氣組食醋明顯深于正常組、沉淀含量高于正常組。污染微生物利用食醋中的糖類化合物進(jìn)行生長代謝,產(chǎn)生二氧化碳導(dǎo)致食醋發(fā)生脹桶現(xiàn)象。通過分離純化,從脹氣食醋中分離得到6株菌,且分離菌均能產(chǎn)生沉淀,其中兩株產(chǎn)生絮狀物沉淀較多,是導(dǎo)致食醋發(fā)生粘稠的主要原因。其中一株可產(chǎn)氣,是導(dǎo)致食醋發(fā)生脹桶的主要污染微生物。食醋脹桶對(duì)食醋品質(zhì)產(chǎn)生不利影響,對(duì)產(chǎn)廠商造成經(jīng)濟(jì)損失。因此,要注意食醋生產(chǎn)過程的衛(wèi)生情況,包括生產(chǎn)用水、用料的安全把控。同時(shí)注意對(duì)食醋成品的殺菌情況做好控制,多次煮沸會(huì)對(duì)食醋品質(zhì)造成一定程度的損害,近年來非熱殺菌引起了人們的重視,其對(duì)食品的風(fēng)味、色澤及營養(yǎng)成分損失較少,因此,開發(fā)采用非熱殺菌方式成為預(yù)防食醋污染的新挑戰(zhàn),是我們下一步的主要研究方向。