陳東杰,姜沛宏,張長(zhǎng)峰,聶小寶,黃寶生,張玉華,*,李長(zhǎng)見(jiàn)

(1.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心,山東濟(jì)南 250103; 2.江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122)

鮮活水產(chǎn)品在物流運(yùn)輸及貯藏過(guò)程中其品質(zhì)受到水質(zhì)、水溫、微生物以及酶等因素的作用而變化。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),水產(chǎn)品的理化指標(biāo)、微生物和氣味與新鮮樣品相比出現(xiàn)明顯差別。目前,水產(chǎn)品品質(zhì)的傳統(tǒng)檢測(cè)手段微生物及理化檢測(cè)雖嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué),但檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)耗力、繁瑣,且結(jié)果具有滯后性;感官評(píng)價(jià)的結(jié)果受主觀因素影響明顯,準(zhǔn)確性低。電子鼻是近年來(lái)新興的快速檢測(cè)技術(shù),具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、無(wú)損等特點(diǎn)[1],電子鼻通常結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)樣品中揮發(fā)氣體進(jìn)行感知和識(shí)別[2],常用的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法主要包括PCA、LDA、PLS和BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BPNN)及多層感知神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(MLP)等。目前電子鼻在水產(chǎn)品快速檢測(cè)方面,已成功用于鱈魚(yú)[3]、帶魚(yú)[4]、鮭魚(yú)[5]、三文魚(yú)[6]、草魚(yú)片[7]、干燥鰱魚(yú)[8]和鱸魚(yú)[9]等水產(chǎn)品的新鮮度評(píng)價(jià)及貨架期檢測(cè)等,而電子鼻對(duì)海鱸魚(yú)品質(zhì)指標(biāo)及優(yōu)勢(shì)腐敗菌的快速定量檢測(cè)模型鮮有報(bào)道。

本研究采用電子鼻對(duì)0 ℃下海鱸魚(yú)進(jìn)行連續(xù)的氣味指紋信息采集,測(cè)定不同保藏時(shí)間的海鱸魚(yú)TVB-N、菌落總數(shù)及假單胞菌數(shù),采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)對(duì)采集氣體指紋信息進(jìn)行分析,通過(guò)偏最小二乘法(PLS)建立揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)、菌落總數(shù)和假單胞菌的快速預(yù)測(cè)模型,為海鱸魚(yú)貯藏期品質(zhì)提供簡(jiǎn)便、實(shí)用、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海鱸魚(yú) 購(gòu)自山東濟(jì)南銀座超市,挑選體型較大,同一年齡、新鮮、健康、活躍的海鱸魚(yú),保活至國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心水產(chǎn)品溫控畜養(yǎng)室,停食暫養(yǎng);鹽酸、氧化鎂、硼酸、甲基紅、碳酸鎂、碳酸鉀、亞甲基藍(lán)等(分析純) 國(guó)藥集團(tuán);板計(jì)數(shù)瓊脂、假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司。

F6/10-104-S 組織破碎機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;EL204-IC電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;BL-75A高溫滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;RX-2智能型人工氣候培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;MS3 digital渦旋混勻器 德國(guó)艾卡設(shè)備有限公司;PL-CJ-2N超級(jí)潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;Scientz-04無(wú)菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司;LRH-70培養(yǎng)箱 上海藍(lán)豹實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;K9840凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器有限公司;FOX4000電子鼻(由18個(gè)傳感器組成,各傳感器響應(yīng)特性見(jiàn)表1) 法國(guó)Alpha MOS公司。

表1 FOX4000電子鼻各傳感器響應(yīng)特性Table 1 FOX4000 sensor response characteristics

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海鱸魚(yú)樣品制備 海鱸魚(yú)暫養(yǎng)結(jié)束后,取鮮活的海鱸魚(yú),去除頭、尾、內(nèi)臟及魚(yú)鱗,用蒸餾水沖洗后分割為大小相近、厚薄均勻的魚(yú)肉(50±5.0) g,用保鮮膜包裝,后置于人工氣候培養(yǎng)箱(0±0.5) ℃貯藏,分別于第0、4、6、8、10、12、14 d取海鱸魚(yú)背部肌肉,測(cè)定TVB-N值、菌落總數(shù)和假單胞菌數(shù),并利用電子鼻進(jìn)行氣味指紋分析。

1.2.2 TVB-N測(cè)定 按照GB/T 2707-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[10]規(guī)定的方法測(cè)定。

1.2.3 菌落總數(shù)測(cè)定 按照GB/T 4789.2-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[11]規(guī)定的方法進(jìn)行。

1.2.4 假單胞菌測(cè)定 采用CFC假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基,在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,計(jì)數(shù)[12]。

1.2.5 電子鼻檢測(cè) 采用組織攪碎機(jī)將魚(yú)肉攪碎后,稱取2.0 g肉樣裝入10 mL樣品瓶,加蓋密封,每個(gè)樣品重復(fù)6次。試驗(yàn)前先對(duì)電子鼻測(cè)定參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,根據(jù)傳感器的響應(yīng)信號(hào),確定電子鼻的測(cè)定參數(shù)為:載氣流速150 mL/min,頂空產(chǎn)生溫度40 ℃,進(jìn)樣體積2000 μL,進(jìn)樣速度2000 μL/s,頂空產(chǎn)生時(shí)間600 s,數(shù)據(jù)采集時(shí)間120 s,延滯時(shí)間400 s。采用PCA和LDA對(duì)樣品進(jìn)行分析,去除樣品中差異較大的個(gè)體。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件對(duì)對(duì)電子鼻傳感器采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,設(shè)定p<0.05為顯著;運(yùn)用PCA、LDA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用PLS對(duì)TVB-N、菌落總數(shù)和假單胞菌的建?？焖龠M(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果由Origin pro 2016軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海鱸魚(yú)冷藏過(guò)程中品質(zhì)指標(biāo)變化

TVB-N值是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品鮮度的重要理化指標(biāo)。如圖1可知,在貯藏過(guò)程中,海鱸魚(yú)的TVB-N值總體升高,貯藏前6 d,TVB-N值變化較小。第6 d后呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì),根據(jù)我國(guó)水產(chǎn)品鮮度的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[13]TVB-N≤30 mg/100 g為新鮮,貯藏到12 d已超過(guò)30 mg/100 g,海鱸魚(yú)已呈現(xiàn)明顯腐敗特征。

圖1 海鱸魚(yú)期間TVB-N含量變化Fig.1 Changes in TVB-N content of Lateolabrax japonicas during storage

菌落總數(shù)指標(biāo)是判斷魚(yú)類新鮮度重要的指標(biāo)。由圖2可知,在貯藏前6 d,海鱸魚(yú)的菌落總數(shù)快速增長(zhǎng),整個(gè)貯藏過(guò)程呈較明顯的S型變化。第8 d菌落總數(shù)較第6 d相比相對(duì)增長(zhǎng)緩慢,第8 d后期菌落總數(shù)繼續(xù)遞增,貯藏12 d后菌落總數(shù)生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。

圖2 海鱸魚(yú)冷藏期間菌落總數(shù)變化Fig.2 Changes in total bacterial counts of Lateolabrax japonicus during storage

假單胞菌為海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一[14-15]。由3可知,隨著海鱸魚(yú)貯藏時(shí)間延長(zhǎng),假單胞菌呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。貯藏前6 d,假單胞菌呈現(xiàn)出指數(shù)增長(zhǎng)的趨勢(shì),貯藏10 d后,假單胞菌增長(zhǎng)相對(duì)緩慢。

圖3 海鱸魚(yú)冷藏期間假單胞桿菌變化Fig.3 Changes in Pseudomonas counts of Lateolabrax japonicus during storage

2.2 海鱸魚(yú)電子鼻傳感器響應(yīng)值分析

圖4為海鱸魚(yú)貯藏第0、14 d的電子鼻傳感器響應(yīng)圖,其中橫軸為電子鼻采集時(shí)間,為120 s;縱坐標(biāo)為18個(gè)傳感器在120 s內(nèi)響應(yīng)值的變化,響應(yīng)值為電子鼻傳感器電導(dǎo)率比值R(R/R0)。由圖4可知,不同的傳感器對(duì)海鱸魚(yú)揮發(fā)氣體的敏感程度不同,但18個(gè)傳感器響應(yīng)值的絕對(duì)值隨時(shí)間變化的趨勢(shì)一致,均是先增大后減小。其中傳感器LY2/LG、LY2/AA、T70/2、LY2/G、LY2/GH、T30/1、P10/1、P40/1、P30/1的響應(yīng)值較大,第14 d時(shí)上述傳感器的響應(yīng)值明顯高于第0 d,說(shuō)明海鱸魚(yú)在貯藏后期,其中的碳?xì)浠衔铩⒋碱愇镔|(zhì)、酮類化合物、胺類化合物等大量增加,可能是由于海鱸魚(yú)貯藏后期,優(yōu)勢(shì)腐敗菌的大量繁殖分解有機(jī)物產(chǎn)生。

圖4 鱸魚(yú)的傳感器信號(hào)圖Fig.4 Sensors single intensity of Lateolabrax japonicas注:a:貯藏第0 d;b:貯藏第14 d。

圖5可知,在貯藏過(guò)程中,18個(gè)響應(yīng)值信號(hào)變化差異明顯。傳感器LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL、T30/1、P10/1、T70/2、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2的響應(yīng)值強(qiáng)度隨海鱸魚(yú)的貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而升高。傳感器LY2/gCT、P10/2、T40/2、T40/1、TA/2的響應(yīng)值信號(hào)強(qiáng)度變化較小。貯藏到10 d后,表征含氮化合物的傳感器LY2/LG、LY2/AA、T70/2、LY2/G、LY2/GH等的響應(yīng)值強(qiáng)度明顯增大,原因是海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌大量增加,產(chǎn)生大量含氮化合物。

圖5 不同貯藏時(shí)間海鱸魚(yú)電子鼻傳感器信號(hào)最大值的變化Fig.5 Change of maximum e-nose sensor signal of Lateolabrax japonicus with different storage time

2.3 海鱸魚(yú)品質(zhì)的主成分分析

主成分分析是將多個(gè)指標(biāo)通過(guò)降維轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾項(xiàng)具有代表性的綜合指標(biāo)的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法[16-19]。通常認(rèn)為累計(jì)貢獻(xiàn)率超過(guò)80%,表明基本包含樣品的信息。第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率分別為87.73%和7.70%,兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率為95.43%。說(shuō)明這兩個(gè)主成分基本上可以反映出海鱸魚(yú)所有的特征。從圖6可以看出,PCA法可將不同貯藏時(shí)間的海鱸魚(yú)區(qū)分開(kāi),且沒(méi)有重疊區(qū)域。

圖6 貯藏期間鱸魚(yú)電子鼻響應(yīng)值信號(hào)的PCA分析Fig.6 PCA analysis of e-nose sensor signals of Lateolabrax japonicus during storage

2.4 海鱸魚(yú)品質(zhì)LDA判別分析

判別分析又稱為線性判別分析，是利用已知類別的樣品建立判別模型,為未知類別的樣本判別的一種統(tǒng)計(jì)方法[20-21]。由圖7可知,第一主成分(LD1)和第二主成分(LD2)的貢獻(xiàn)率分別為90.85%和6.09%,兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率為96.94%。說(shuō)明這兩個(gè)主成分基本上可以反映出海鱸魚(yú)所有的特征信息。圖7中將不同貯藏時(shí)間的海鱸魚(yú)分到三個(gè)象限中,將LDA判別結(jié)果與TVB-N和菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)結(jié)合分析,可將0 ℃下海鱸魚(yú)貯藏過(guò)程分為三個(gè)階段:0～6 d為一級(jí)新鮮;8～10 d為二級(jí)新鮮;12 d后為腐敗。

圖7 貯藏期間鱸魚(yú)電子鼻響應(yīng)值信號(hào)的LDA分析Fig.7 LDA analysis of e-nose sensor signals of Lateolabrax japonicus during storage

2.5 海鱸魚(yú)TVB-N、菌落總數(shù)和假單胞菌快速預(yù)測(cè)模型建立

以不同貯藏時(shí)間下海鱸魚(yú)的電子鼻最大響應(yīng)值為自變量,以海鱸魚(yú)的TVB-N值、TMA值、菌落總數(shù)及假單胞菌為因變量,利用PLS得出TVB-N、TMA值、菌落總數(shù)和假單胞菌的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的關(guān)系。隨機(jī)選取28個(gè)樣品作為建模集,10個(gè)為驗(yàn)證集。圖8為T(mén)VB-N菌落總數(shù)和假單胞菌的PLS預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的關(guān)系,TVB-N、菌落總數(shù)和假單胞菌模型的決定系數(shù)(R2)分別為0.9737、0.8778、0.5943,三個(gè)預(yù)測(cè)模型p值均小于0.05,說(shuō)明回歸模型具有顯著性。由于假單胞菌PLS預(yù)測(cè)模型的決定系數(shù)較低,模型擬合度不高,不適合用PLS建立假單胞菌預(yù)測(cè)模型。由表2可知,TVB-N值及菌落總數(shù)的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的平均相對(duì)誤差均小于16%。

圖8 海鱸魚(yú)理化指標(biāo)的建模集 PLS 分析Fig.8 PCR analysis of physical-chemical indexes of Lateolabrax japonicus

表2 預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Verification tests of prediction model

3 結(jié)論

分析不同貯藏時(shí)間海鱸魚(yú)的TVB-N、菌落總數(shù)、假單胞菌和電子鼻氣體指紋信息得出,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),TVB-N、菌落總數(shù)和假單胞菌不斷上升。PCA及LDA分析可以將不同貯藏時(shí)間的海鱸魚(yú)很好地區(qū)分開(kāi),說(shuō)明利用電子鼻可以說(shuō)實(shí)現(xiàn)對(duì)海鱸魚(yú)品質(zhì)快速檢測(cè)具有可行性。采用PLS對(duì)海鱸魚(yú)的TVB-N、菌落總數(shù)、假單胞菌與電子鼻最大響應(yīng)值進(jìn)行建模預(yù)測(cè)分析,建立擬合模型,模型決定系數(shù)R2分別為0.9737、0.8778、0.5943，假單胞菌預(yù)測(cè)模型R2較低，擬合度不高，故不適合用PLS建立假單孢菌預(yù)測(cè)模型。驗(yàn)證結(jié)果表明,TVB-N值和菌落總數(shù)預(yù)測(cè)模型擬合度較高,預(yù)測(cè)效果較好。