周 艷,曾維偉,朱筱玉,呂鳳霞,別小妹,趙海珍,陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)總體來說是由酸性物質(zhì)、細(xì)菌素、二氧化碳、過氧化氫、雙乙酰、類細(xì)菌素等組成的復(fù)雜體系[1-4]。其中,細(xì)菌素近年來受到了廣泛的關(guān)注,但其主要應(yīng)用于果蔬及水產(chǎn),在冷鮮肉中應(yīng)用較少。Anacarso等[5]從火腿中分離的植物乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素具有良好的抗腐敗菌和致病菌活性。Shelegueda[6]獲得的一株腸球菌產(chǎn)細(xì)菌素與殼聚糖、乳酸鈉共同作用能夠抑制魚體中嗜冷菌群的生長。Zhou[7]指出，一株乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素能抑制草莓灰霉病孢子萌發(fā)。Shi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，明串珠菌K7產(chǎn)細(xì)菌素能夠有效抑制牛奶中單增李斯特菌的生長。

豬肉含水量高,富含蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪酸,易受到微生物污染、易腐敗,從而導(dǎo)致肉類行業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失[9]。如何保證豬肉的品質(zhì)和安全性,是目前亟需解決的問題。肉類主要腐敗菌包括假單胞菌、不動桿菌、莫拉氏菌、乳酸桿菌等[10],通常腐敗微生物不會對人體健康造成不利影響,但當(dāng)其數(shù)量達(dá)到一定程度時,會造成人體胃腸道紊亂[11]。然而,目前所采用的冷藏手段不能完全保證豬肉的安全性以及滿足消費(fèi)者的需求[9],所以將防腐劑與冷藏手段相結(jié)合是一個可行的方向[12]。

應(yīng)用于豬肉的防腐劑根據(jù)其來源可分為化學(xué)防腐劑和生物源防腐劑兩種,目前控制食品微生物的主要措施是添加化學(xué)防腐劑,但由于安全性問題,現(xiàn)代食品工業(yè)越來越注重生物源防腐劑的使用[13]。目前,微生物源保鮮劑在水產(chǎn)品中的應(yīng)用已有報道[14],同樣對于動物性食品,其在豬肉中的應(yīng)用具有一定價值。

嗜酸乳桿菌NX2-6是由內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)牧民家庭中以傳統(tǒng)發(fā)酵方法制作的酸馬奶中分離得到的,其產(chǎn)的細(xì)菌素acidocin NX2-6具有廣譜抗菌活性。劉曉茜等[15]前期研究表明,嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)抑菌物質(zhì)對櫻桃番茄具有良好的保鮮效果。因此,嗜酸乳桿菌NX2-6所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有作為生物防腐劑應(yīng)用于冷鮮肉防腐的潛力。本實驗以菌落總數(shù)、pH、揮發(fā)性鹽基氮、感官評價為鮮度指標(biāo),探討嗜酸乳桿菌NX2-6細(xì)菌素對冷鮮豬肉的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

后腿精瘦肉 蘇果超市雨潤集團(tuán)冷鮮肉專柜;Nisin 浙江銀象生物科技有限公司;所有培養(yǎng)基用試劑 均為國藥-滬試,分析純。

HYG-A全溫?fù)u瓶柜 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;SX-700高壓蒸汽滅菌器 日本TOMY公司;UV-2450型紫外分光光度計 日本島津公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司;HGPN型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;ORION 3-star pH計 美國Thermo公司;Haier SC-350立式冷藏柜 青島海爾特種冰柜有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)的效價研究

1.2.1.1 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)的制備 以脫脂乳培養(yǎng)基,由甘油管接種發(fā)酵12 h作為種子液,以8%的接種量接入實驗室改良的發(fā)酵培養(yǎng)基(蛋白胨20.0 g/L,牛肉浸膏20.0 g/L,酵母浸膏10.0 g/L,K2HPO4·3H2O 3.0 g/L,檸檬酸三鈉6.0 g/L,乙酸鈉8.0 g/L,吐溫-80 3.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.40 g/L,MnSO4·H2O 0.076 g/L)中,發(fā)酵48 h后,5000 r/min離心30 min,棄沉淀,獲得上清液(發(fā)酵上清為嗜酸乳桿菌NX-6細(xì)菌素粗品,考慮到使用成本,直接將粗品用于下步實驗,下稱“嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)”)。

1.2.1.2 檢測菌懸液的制備 將檢測菌藤黃微球菌接至斜面,37 ℃培養(yǎng)24 h,再接入100 mL種子培養(yǎng)基(NA),33 ℃,180 r/min,培養(yǎng)8 h,至菌對數(shù)生長中后期,取出置于冰箱備用,作為檢測種子液。

1.2.1.3 Nisin標(biāo)準(zhǔn)液的配制 準(zhǔn)確稱取8 g Nisin(103IU/mg),溶于100 mL 0.02 mol/L HCl中,配制成8000 IU/mL Nisin標(biāo)準(zhǔn)液備用,需要時用0.02 mol/L HCl稀釋即可。

1.2.1.4 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)效價的測定 利用牛津杯單層瓊脂法:在18 cm平板上放入牛津杯后倒入混有濃度為106～107CFU/mL的指示菌的培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯,在各孔中加入不同濃度的嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)和不同濃度的Nisin,在37 ℃培養(yǎng)12 h,測定抑菌圈直徑。根據(jù)Nisin的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)的抑菌圈大小計算效價。

1.2.2 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)在豬肉保鮮上的應(yīng)用

1.2.2.1 豬肉處理 獲取豬肉肉段后,用冰盒運(yùn)送至實驗室,用無菌水沖洗肉段,于無菌鋼絲網(wǎng)上瀝干,在超凈臺中進(jìn)行切分(每段約20 g),隨機(jī)將豬肉分為如下5組(每組約100 g):

C組:對照組,浸泡蒸餾水30 min作為對照;N組:陽性對照組,浸泡0.5%(質(zhì)量體積比,以0.02 mol/L的稀鹽酸為溶劑,下同)Nisin溶液30 min;1%S組:低劑量處理組,以1%嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液浸泡30 min;2%S組:中劑量處理組,以2%嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液浸泡30 min;4%S組:高劑量處理組,以4%嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液浸泡30 min(預(yù)實驗表明,2%S組與0.5%N組保鮮效果較為接近,故選擇2%S為中劑量處理組,并設(shè)置1%S與4%S為低劑量處理和高劑量處理)。浸泡完成后,以無菌鋼絲網(wǎng)瀝干30 min后,分裝于無菌的均質(zhì)袋(北京路橋)中,在冰箱(4±1) ℃中存放9 d。樣品在1、3、5、7和9 d分別進(jìn)行微生物和理化測定。

1.2.2.2 菌落總數(shù)測定 根據(jù)GB4789.2-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定[12],所有的計數(shù)均表示為lg CFU/g。

1.2.2.3 pH的測定 將10 g肉樣品在100 mL蒸餾水中均質(zhì),并將混合物過濾,取濾液用電子pH計測定其pH。并設(shè)置重復(fù)。

1.2.2.4 揮發(fā)性鹽基氮的測定 總揮發(fā)性鹽基氮利用水蒸氣蒸餾法進(jìn)行測定。水蒸氣蒸餾法是通過蒸餾加入MgO的均質(zhì)肉樣品進(jìn)行。餾出液用含2%硼酸的水溶液進(jìn)行收集,混合指示劑是用0.1 g甲基紅溶解到100 mL乙醇的溶液。然后,硼酸溶液用0.02 mol/L的鹽酸溶液滴定。TVB-N值(mg/100 g豬肉)取決于鹽酸的消耗量，計算公式如下。

式中:X-試樣中揮發(fā)性鹽基氮的含量(mg/100 g);V-測定用樣液消耗鹽酸溶液體積(mL);V′-試劑空白消耗鹽酸溶液體積(mL);c-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液實際濃度(mol/L);m-試樣質(zhì)量(g)。

1.2.2.5 感官評定 豬肉樣品的感官分析是由六個(三男三女)經(jīng)過培訓(xùn)的評價者進(jìn)行。顏色、氣味、質(zhì)地根據(jù)感官評價標(biāo)準(zhǔn)(表1)進(jìn)行打分,其中1和10分別為最低和最高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，感官評分為6被認(rèn)為是可接受的界限。

表1 低溫貯藏條件下豬肉的感官指標(biāo)評價標(biāo)準(zhǔn)(分)[16]Table 1 Scale for sensory evaluation of meat under the condition of low temperature storage(score)[16]

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0中LSD(最小顯著性差異法)對試驗中各組指標(biāo)的變化進(jìn)行顯著性分析,p<0.05為顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)的效價研究

嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)的抑菌圈為(21.54±0.42) mm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1918x+0.0267(R2=0.9979)得出嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)的效價為14390.37 IU。

圖1 Nisin效價標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of Nisin

2.2 嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)在豬肉保鮮上的應(yīng)用

2.2.1 不同處理對菌落總數(shù)的影響 冷鮮豬肉在儲藏過程中,其表面的細(xì)菌繁殖會加速肉中蛋白質(zhì)的分解腐敗,因此菌落總數(shù)的變化可以反映豬肉的腐敗程度[17]。試驗表明,Nisin和不同濃度嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液處理均能抑制豬肉中微生物的生長。由圖2可見,在1～9 d的儲藏過程中,對照組菌落總數(shù)水平及微生物生長速度始終高于各處理組,4%S組效果最佳,而N組效果與2%S組無明顯差異。到9 d時,所有處理組菌落總數(shù)水平均低于N組,由此可見,較Nisin而言,嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)作用效果更持久。實驗表明,嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌物質(zhì)能夠明顯抑制冷鮮豬肉中微生物的生長,4%組具有最佳作用效果,從3 d開始,就可將菌落總數(shù)水平控制在對照組的1/10以下。

圖2 菌落總數(shù)隨著儲存時間的變化Fig.2 The changes of TAC in the process of storage

2.2.2 不同處理對pH的影響 豬肉在貯藏過程中,由于所含水解酶及微生物的作用,其pH會發(fā)生變化。由圖3可知,豬肉的pH在貯藏過程中呈現(xiàn)下降后上升的趨勢。這可能與冷鮮豬肉在貯藏前期糖原酵解產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致pH下降有關(guān)。到貯藏中后期,豬肉源組織蛋白酶被釋放出來,在加上微生物作用會導(dǎo)致豬肉的蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨及胺類等堿性揮發(fā)性物質(zhì),從而使pH上升[18]。對照組pH比4%S組提前2 d開始上升,且上升速度較快。Nisin組、1%S組和2%組pH化拐點并沒有延遲,但其上升速度受到了一定的抑制。由此可見,2%S組和4%S組處理能夠很好地延緩豬肉pH的變化。由此可見,嗜酸乳桿菌NX-6抑菌物質(zhì)能通過抑制豬肉中微生物的生長,減少由微生物導(dǎo)致的蛋白質(zhì)分解,從而延緩pH的變化。

圖3 pH隨著儲存時間的變化Fig.3 The changes of pH in the process of storage

2.2.3 不同處理對揮發(fā)性鹽基氮的影響 揮發(fā)性鹽基氮是動物性食品在貯藏過程中,因肌肉中內(nèi)源酶和細(xì)菌共同作用,使得蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮物質(zhì),通?？梢宰鳛槿忸惓跗诟瘮〉囊粋€評定標(biāo)準(zhǔn)[19-20]。由圖4可知,貯藏期間,豬肉中揮發(fā)性鹽基氮含量呈逐步上升趨勢,其中,對照組在7 d后就已高達(dá)28.56 mg/100 g。

圖4 揮發(fā)性鹽基氮隨著儲存時間的變化Fig.4 The changes of TVB-N in the process of storage

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB T5009.44-2003肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[21]的分析方法,豬肉食用標(biāo)準(zhǔn)為TVB-N≤20 mg/100 g,表明對照組豬肉在7 d時就已低于食用標(biāo)準(zhǔn)。而經(jīng)嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液處理的豬肉中揮發(fā)性鹽基氮含量上升趨勢明顯減緩,在9 d時,4% S組達(dá)到國標(biāo)最高檢出限。由此可見,嗜酸乳桿菌NX2-6抑菌溶液能通過抑制豬肉中微生物的生長,有效減少由細(xì)菌作用產(chǎn)生的揮發(fā)性鹽基氮,4% S組處理效果最佳,可將豬肉的腐敗延遲2 d。

2.2.4 不同處理對感官品質(zhì)的影響 感官評分可以直觀地反映豬肉在儲存的品質(zhì)變化。實驗初始,豬肉氣味正常,具有豬肉特有新鮮氣味、紅色與白色肌肉色澤,粘液透明,肌肉致密,彈性恢復(fù)良好。隨著貯藏過程的進(jìn)行,其顏色、質(zhì)地、氣味三項感官指標(biāo)的變化均呈明顯下降趨勢。從表2可見,在貯藏過程中,除2%S組在第5 d時顯著降低外(p>0.05),各處理組顏色評分與對照組沒有顯著性差異(p>0.05)。在色澤方面,N組在7～9 d顯著優(yōu)于其他各組(p<0.05)。第3、7、9 d時,1%S組、2%S組和4%S組氣味評分顯著高于對照組(p<0.05),其中4%S組最優(yōu)。由此可見,嗜酸乳桿菌NX-6抑菌溶液處理有利于減緩豬肉的氣味劣變,但不利于其顏色和質(zhì)地的保持。

表2 感官指標(biāo)變化Table 2 The change of sensory evaluation in the process of storage

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明,冷鮮豬肉經(jīng)4%嗜酸乳桿菌NX-6抑菌溶液浸泡處理30 min后,于4 ℃條件下貯藏9 d,可將豬肉腐敗延緩2 d。從3 d開始,4%S組的菌落總數(shù)水平就始終在對照組的1/10以下;pH變化拐點比對照組延遲2 d出現(xiàn),且變化趨勢明顯緩于對照組;TVB-N值比對照組推遲2 d到達(dá)國標(biāo)最高檢出限;從3 d開始，中高劑量處理組氣味評分始終顯著優(yōu)于對照組(p<0.05)。由于嗜酸乳桿菌NX-6抑菌溶液濃度過高不利于豬肉顏色和質(zhì)地的保持,故不宜選擇更高濃度進(jìn)行處理。

與常見生物源保鮮劑Nisin相比,嗜酸乳桿菌NX-6細(xì)菌素存在一定優(yōu)勢,但也有些許不足。經(jīng)4%嗜酸乳桿菌NX-6抑菌溶液處理后的樣品,顏色與質(zhì)地評分低于Nisin組,其他各項指標(biāo)均優(yōu)于Nisin處理組。此外,Nisin在貯藏后期抑菌效果明顯下降,而嗜酸乳桿菌NX-6細(xì)菌素則抑菌效果較Nisin更為穩(wěn)定和持久,在7 d仍能將菌落總數(shù)控制在7 lg CFU/g以內(nèi)。

綜上所述,嗜酸乳桿菌NX-6細(xì)菌素在冷鮮豬肉保鮮中具有較大的潛力。在后續(xù)研究中,基于對豬肉感官品質(zhì)的綜合考慮,可以選擇Nisin與本產(chǎn)品進(jìn)行復(fù)配,在保證微生物生長得到抑制的同時,減緩豬肉色澤的劣變,從而取得更好的保鮮效果。