劉陽(yáng)星月，張 迪，姚亞亞，苗字葉，劉 壯，李慧靜*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

大豆在豆類中的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高，含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素和微量元素[1]，大豆蛋白質(zhì)只需經(jīng)過適當(dāng)加工，其消化率接近于牛奶等動(dòng)物蛋白，因此廣泛存在于大量食品中，但同時(shí)大豆作為八大食物過敏原之一也受到了極大關(guān)注[2]。大豆過敏主要是由大豆蛋白引起的[3]。食物過敏多數(shù)屬于免疫學(xué)的I型變態(tài)反應(yīng)，反應(yīng)癥狀發(fā)生迅速，與機(jī)體內(nèi)的IgE有關(guān)，故又稱為IgE介導(dǎo)的速發(fā)型變態(tài)（超敏）反應(yīng)[4]。

近年，食物過敏安全問題日益顯著，需要提高對(duì)食物過敏原的檢測(cè)水平，通過在食品外包裝上對(duì)過敏原的標(biāo)注，提醒過敏人群避免食用該食物[5]。因此，找到快速簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的過敏原檢測(cè)方法迫在眉睫。

本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)引起我國(guó)嬰幼兒大豆過敏的致敏原主要如下：11S球蛋白G1的A1鏈、G2的A2鏈、G5的A3鏈；7S球蛋白α、α’和β亞基；11S突變體C88s晶體結(jié)構(gòu)A鏈與11S突變體C12g的A鏈；大豆凝集素2,6-戊糖復(fù)合體A鏈。11S突變體C12g的A鏈、11S突變體C88s晶體結(jié)構(gòu)A鏈與大豆凝集素2,6-戊糖復(fù)合體的A鏈為新過敏原，11S球蛋白G1中的A1鏈、G1 A1ab1b中的A1a鏈為已批準(zhǔn)的過敏原Gly m 6.0101。11S球蛋白G2為已批準(zhǔn)的過敏原Gly m 6.0201，由A2酸性亞基和B1a堿性亞基構(gòu)成，本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)其中主要起致敏作用的為A2酸性亞基，目前國(guó)內(nèi)外還鮮有對(duì)11S球蛋白G2中A2鏈中具體抗原表位的研究[2]。不同國(guó)家所鑒定出的大豆過敏原組分及其致敏概率并不完全相同，這主要是由各地區(qū)大豆品種的差異、加工工藝的不同以及所采集的過敏者的血清標(biāo)本不一致導(dǎo)致的[2]。因此市售進(jìn)口的食品大豆過敏原檢測(cè)試劑盒或試紙條并不適合我國(guó)人群。

本研究團(tuán)隊(duì)擬建立適合我國(guó)大豆過敏人群的食品中大豆過敏原的免疫學(xué)方法，如雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法[6-7]，為了使檢測(cè)結(jié)果更加精準(zhǔn)，需要找到精確的抗體。免疫細(xì)胞一般很難借助其表面受體來識(shí)別整個(gè)抗原分子，僅能識(shí)別蛋白質(zhì)抗原分子上的特定部分，這一特定部位就是表位，也可稱為抗原決定簇[6,8]。表位一般由5～7 個(gè)氨基酸殘基組成，最多不超過30 個(gè)氨基酸[3]。表位代表抗原分子上的一個(gè)免疫活性區(qū)，可與抗體分子或免疫細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，嚴(yán)格來說，抗體的特異性針對(duì)的是抗原表位而不是完整的蛋白質(zhì)抗原分子[6,8]。B細(xì)胞表位是抗原中可被B細(xì)胞抗原受體或抗體特異性識(shí)別并相互結(jié)合的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)[9-10]。表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)[11]，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位有助于找到精準(zhǔn)的抗體。因此，本研究擬以引起我國(guó)嬰幼兒大豆過敏的主要過敏原的新變體11S球蛋白G2中A2鏈為例預(yù)測(cè)其抗原表位。

目前，B細(xì)胞表位分析的方法主要有以下幾種：1）表位預(yù)測(cè)方法，根據(jù)表面可及性方案[12]、親水性方案（其中以Hopp-Woods[13]方案最為著名）、可塑性方案[14]、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方案[15]、抗原性方案[16]、電荷分布方案等方法預(yù)測(cè)表位[17-19]，這種方法適用于已知一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽抗原或是蛋白質(zhì)的線性結(jié)合表位的預(yù)測(cè)[6]。在吳加金等[6]編的Goldkey軟件中，以Hopp-Woods、反向高效液相色譜的肽滯留時(shí)間、表面可及性、可塑性、電荷分布、抗原性6 種參數(shù)綜合考慮，得出了綜合判斷圖，在閾值以上的峰即認(rèn)為是預(yù)測(cè)的抗原表位。2）傳統(tǒng)化學(xué)“切割”法或酶法，分為用化學(xué)法或酶“切割”抗原法和水解抗原-抗體復(fù)合物法。用化學(xué)法或酶“切割”抗原法即運(yùn)用化學(xué)方法或生物學(xué)方法處理抗原分子得到多肽碎片，然后再利用單克隆抗體篩選能與其發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)的片段[6]。水解抗原-抗體復(fù)合物法即利用抗原-抗體的結(jié)合部位能夠抵抗蛋白酶的水解這一原理，水解復(fù)合物，從而找到結(jié)合部位[6]。3）合成肽庫(kù)的方法，分為有機(jī)合成法和噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)方法[6]。有機(jī)合成法即利用固相肽合成技術(shù)，合成含有各種可能序列的短肽，再通過熒光標(biāo)記或ELISA法進(jìn)行篩選，得到結(jié)合表位[6]，也可使合成多肽與特異性抗體反應(yīng)，而后通過重疊多肽掃描技術(shù)確定結(jié)合表位[20]；噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)方法即將包被后的單抗加入到噬菌體肽庫(kù)中，充分反應(yīng)后，用洗脫液處理得到結(jié)合狀態(tài)的噬菌體，使其侵染宿主大腸桿菌擴(kuò)增后回收，而后繼續(xù)與已包被的單抗反應(yīng)進(jìn)行篩選，重復(fù)3、4 輪后，即可獲得與單抗結(jié)合較為緊密的噬菌體克隆，最后通過DNA序列分析，即可得知噬菌體克隆攜帶的外源肽序列，從而得知抗原表位[6]。4）X-射線衍射方法，X-射線可以揭示出復(fù)合物中抗原與抗體結(jié)合的位點(diǎn)以及結(jié)合表位的類型，但此方法耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，對(duì)蛋白質(zhì)的純度要求極高[20]。5）核磁共振分析法，抗原抗體結(jié)合時(shí)，抗原結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基的動(dòng)力學(xué)值會(huì)發(fā)生改變，核磁共振技術(shù)可以根據(jù)動(dòng)力學(xué)值的改變定位抗原表位[20]。6）質(zhì)譜技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)主要針對(duì)的是分子間的非共價(jià)鍵反應(yīng)，從而對(duì)抗原抗體間的特異性結(jié)合進(jìn)行分析，找出結(jié)合位點(diǎn)[20]。

通過實(shí)驗(yàn)方式分析B細(xì)胞表位，耗時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)用高，工作量大，本研究擬參考表位預(yù)測(cè)方法，綜合使用生物信息學(xué)軟件對(duì)11S球蛋白G2中A2鏈的B細(xì)胞結(jié)合表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，首先在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢11S球蛋白G2中A2鏈的序列，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢11S球蛋白G2中A2鏈的同源蛋白，進(jìn)而利用SWISS-MODEL在11S球蛋白G2中A2鏈同源蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上建立11S球蛋白G2中A2鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，并使用Deep View 4.1軟件對(duì)該三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，為后期使用DiscoTope 2.0 Server軟件預(yù)測(cè)B細(xì)胞構(gòu)象表位做準(zhǔn)備，使用DNAStar、SOPMA、BepiPred和ABCpred等軟件綜合預(yù)測(cè)11S球蛋白G2中A2鏈的線性B細(xì)胞表位[3,20-22]。本研究將為后期開發(fā)適合檢測(cè)我國(guó)大豆過敏人群的食品大豆過敏檢測(cè)技術(shù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 11S球蛋白G2中A2鏈的序列

登錄NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)[3,20]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）查詢11S球蛋白G2中A2鏈的序列（編號(hào)gi|121277），得到含有278 個(gè)氨基酸殘基的序列：LRE QAQQNECQIQKLNALKPDNRIESEGGFIETWNPNNKPF QCAGVALSRCTLNRNALRRPSYTNGPQEIYIQQGNGIF GMIFPGCPSTYQEPQESQQRGRSQRPQDRHQKVHRFR EGDLIAVPTGVAWWMYNNEDTPVVAVSIIDTNSLENQL DQMPRRFYLAGNQEQEFLKYQQQQQGGSQSQKGKQ QEEENEGSNILSGFAPEFLKEAFGVNMQIVRNLQGENE EEDSGAIVTVKGGLRVTAPAMRKPQQEEDDDDEEEQP QCVETDKGCQRQSK。

1.1.2 11S球蛋白G2中A2鏈的同源蛋白

登錄PDB數(shù)據(jù)庫(kù)[20]（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）查找11S球蛋白G2中A2鏈的同源蛋白[23]。

1.1.3 11S球蛋白G2中A2鏈同源建模軟件及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)軟件

SWISS-MODEL為基于因特網(wǎng)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)自動(dòng)比較建模的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（https://www.swissmodel.expasy.org/）[3,20,24-25]，Deep View 4.1軟件可以用來分析蛋白質(zhì)PDB文件，評(píng)估SWISS-MODEL建立的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的穩(wěn)定性[20,23]。

1.1.4 DNAStar

DNAStar[3,20]的子程序Protean，軟件版本為7.1.0。DNAStar的子程序Protean可以根據(jù)蛋白質(zhì)的序列預(yù)測(cè)11S球蛋白G2中A2鏈的親水性、表面可及性、柔韌性和抗原指數(shù)[20,22]。親水性指數(shù)高的區(qū)域說明這些區(qū)域暴露在抗原表面的幾率較大，有極大可能為B細(xì)胞抗原表位；表面可及性表示抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性，擁有表面可及性，才具有與抗體結(jié)合的可能；柔韌性區(qū)域易發(fā)生折疊和扭曲，有較大可能性形成表位，容易與抗體進(jìn)行結(jié)合；抗原性區(qū)域有可能成為表面抗原[26]。此軟件考慮因素較多，準(zhǔn)確性相對(duì)較高。

1.1.5 SOPMA

SOPMA[3,20,27]（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）軟件采用Levin同源預(yù)測(cè)、PredictProtein中的PHD、GOR、雙重預(yù)測(cè)和SOPMA 5 種方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后將結(jié)果優(yōu)化組合，綜合整理成一個(gè)結(jié)果，SOPMA采用這些方法建立出已知二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，庫(kù)中的每個(gè)蛋白質(zhì)都經(jīng)過了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，然后便可用從庫(kù)中得到的信息來預(yù)測(cè)目標(biāo)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)[28-29]。因?yàn)闊o規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角一般為凸出結(jié)構(gòu)，所以常常暴露在抗原表面，與α-螺旋和β-折疊相比，它們更容易與抗體結(jié)合，有較大可能性成為過敏原表位[20]。

1.1.6 BepiPred 1.0 Server

BepiPred 1.0 Server[3,20,30]（http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0/）。BepiPred 1.0 Server使用隱馬爾可夫模型[31]和親水性參數(shù)評(píng)分來預(yù)測(cè)線性B細(xì)胞結(jié)合表位[20]。這種方法相對(duì)于只是依賴于分析氨基酸物理化學(xué)性質(zhì)的技術(shù)來說，預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性有了微小的提高[17]。

1.1.7 ABCpred

ABCpred[20,32]（http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）服務(wù)器可以利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）模型預(yù)測(cè)抗原序列中的B細(xì)胞表位[20]。在700 個(gè)B細(xì)胞的抗原基和700 個(gè)非抗原決定肽的非冗余數(shù)據(jù)集上，使用5 倍的交叉驗(yàn)證測(cè)試，對(duì)前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和復(fù)發(fā)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行評(píng)估[17]。對(duì)10～20 個(gè)氨基酸的輸入序列窗口進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示通過對(duì)16 個(gè)氨基酸的重復(fù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)測(cè)試獲得了66%的準(zhǔn)確度[17]。

1.1.8 DiscoTope 2.0 Server

DiscoTope 2.0 Server[20,33]（http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope/）。DiscoTope服務(wù)器根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，利用新的表位傾向的氨基酸評(píng)分和表面可及性預(yù)測(cè)B細(xì)胞構(gòu)象表位，最后的分?jǐn)?shù)結(jié)合在空間接近的殘留物的傾向分?jǐn)?shù)和接觸數(shù)來計(jì)算[18,19,34]。

1.2 方法

1.2.1 11S球蛋白G2中A2鏈同源建模

選擇SWISS-MODEL服務(wù)器中的Alignment Mode，同時(shí)輸入11S球蛋白G2中A2鏈的序列和在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的其同源蛋白的序列，注意輸入序列格式必須是FASTA、Clustal、Promod、普通字符串或一個(gè)有效的UniProtKB AC。對(duì)11S球蛋白G2中A2鏈進(jìn)行同源建模。一般來說，僅當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的同源性達(dá)到30%以上時(shí)，使用已知蛋白的三維結(jié)構(gòu)作為模板建立目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型才具有一定的可靠性[20]。

1.2.2 使用Deep View 4.1軟件進(jìn)行評(píng)估

使用Deep View 4.1軟件對(duì)SWISS-MODEL服務(wù)器建成的11S球蛋白G2中A2鏈的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。將SWISS-MODEL服務(wù)器得出的結(jié)果保存為PDB格式，在Deep View 4.1軟件直接打開，也可以點(diǎn)擊File→Import，出現(xiàn)對(duì)話框，在Name欄中鍵入PDB ID，再點(diǎn)擊“Grab from SERVER”下的“PDB File”，模型便會(huì)以棍狀形式出現(xiàn)。在菜單Select中點(diǎn)擊ALL，再在菜單Wind中點(diǎn)擊Ramachandran Plot，最后在Color中點(diǎn)擊Secondary Structure Succession就能得到Ramachandran圖。

1.2.3 DNAStar的使用

首先從EditSeq開始，點(diǎn)擊File→New→New Protein，然后輸入目標(biāo)序列，保存，再點(diǎn)擊File→Send Sequence To→Protean即可得到結(jié)果。

1.2.4 SOPMA的使用

將11S球蛋白G2中A2鏈的序列輸入到SOPMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，設(shè)定“Number of conformational states”為4（Helix, Sheet, Turn, coil），“Output width”為70，“Similarity threshold”為8，“Window width”為17。

1.2.5 BepiPred的使用

打開BepiPred網(wǎng)頁(yè)后提交FASTA格式的11S球蛋白G2中A2鏈序列即可。

1.2.6 ABCpred的使用

打開ABCpred服務(wù)器，提交11S球蛋白G2中A2鏈的序列，設(shè)定“Threshold”為0.7，“window length”為10，“overlapping filter”為on。

1.2.7 DiscoTope 2.0 Server的使用

打開DiscoTope 2.0 Server服務(wù)器，選擇本地磁盤中擁有同源建模PDB格式的結(jié)果的文件，接下來為抗原表位的鑒定選擇DiscoTope閾值，較高的值對(duì)應(yīng)更高的特異性[18,34]。分?jǐn)?shù)與靈敏度、特異性關(guān)系見表1。0.75特異性表示非表位殘余的25%被預(yù)測(cè)為表位的一部分，0.47的靈敏度表示表位殘基的47%被預(yù)測(cè)為表位的一部分，可根據(jù)自己的需求來選擇，本研究中選擇默認(rèn)值-3.7[34]。

表1 分?jǐn)?shù)與靈敏度、特異性的關(guān)系[18,34]Table 1 Relationship between score and sensitivity and specificity

2 結(jié)果與分析

2.1 11S球蛋白G2中A2鏈的同源建模結(jié)果與評(píng)估

在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中找到11S球蛋白G2中A2鏈的17 種同源蛋白，其中相似度最高的為1FXZ（大豆球蛋白A1aB1b三聚體），同源性達(dá)到了69%，選擇該蛋白為模板，將11S球蛋白G2中A2鏈與1FXZ的蛋白序列對(duì)比輸入到SWISS-MODEL軟件的Target-Template Alignment模式，對(duì)11S球蛋白G2中A2鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1所示。將SWISS-MODEL中得到的結(jié)果提交到Deep View 4.1中，對(duì)所做出的11S球蛋白G2中A2鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估，得到Ramachandran Plot，如圖2所示。

圖1 11S球蛋白G2中A2鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Tertiary structure of the A2 chain of 11S globulin G2

圖2 11S球蛋白G2中A2鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)的Ramachandran PlotFig. 2 Ramachandran Plot of the tertiary structure of the A2 chain of 11S globulin G2

Ramachandran Plot是以φ為橫坐標(biāo)，ψ為縱坐標(biāo)，規(guī)定φ,ψ角允許的構(gòu)象區(qū)域的一個(gè)圖形[35]。φ,ψ角為α碳的兩面角，φ表示一個(gè)肽單位中α碳左邊C—N鍵的旋轉(zhuǎn)角度，ψ表示α碳右邊C—C鍵的旋轉(zhuǎn)角度，理論上C—N鍵和C—C鍵可以自由旋轉(zhuǎn)，但實(shí)際中由于分子中各個(gè)基團(tuán)的空間障礙和作用力的影響，Ramachandran Plot就出現(xiàn)了允許出現(xiàn)的區(qū)域和不允許出現(xiàn)的區(qū)域[35]。Ramachandran Plot包含3個(gè)區(qū)域：允許區(qū)、最大允許區(qū)和不允許區(qū)。如圖2所示，黃線區(qū)域內(nèi)為允許區(qū)，該區(qū)構(gòu)象可以穩(wěn)定存在。藍(lán)線區(qū)域內(nèi)黃線區(qū)域外為不完全允許區(qū)，該區(qū)構(gòu)象在立體化學(xué)中可以存在，但是不穩(wěn)定。剩余區(qū)域?yàn)椴辉试S區(qū)，該區(qū)構(gòu)象不能存在。一般來說，落在允許區(qū)和不完全允許區(qū)的氨基酸殘基占所有氨基酸殘基的比例高于90%的，即可認(rèn)為該模型的構(gòu)象符合立體化學(xué)的規(guī)則[35]。由圖2可知該模型的構(gòu)象符合立體化學(xué)的規(guī)則。

2.2 DNAStar

圖3 DNAStar預(yù)測(cè)11S球蛋白G2中A2鏈的親水性、柔韌性、抗原指數(shù)以及表面可及性Fig. 3 DNAStar prediction of the hydrophilicity, flexibility, antigen index, and surface accessibility of the A2 chain in 11S globulin G2

應(yīng)用DNAStar的子程序Editseq和protean預(yù)測(cè)11S球蛋白G2中A2鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖3所示，當(dāng)圖中區(qū)域滿足親水性和抗原指數(shù)大于0、同時(shí)表面可及性指數(shù)大于1時(shí)則該區(qū)域?yàn)榭乖砦坏膬?yōu)勢(shì)區(qū)域，關(guān)于柔韌性指數(shù)則其中有矩形覆蓋的部分為抗原表位的優(yōu)勢(shì)區(qū)域，同時(shí)考慮這4個(gè)指標(biāo)[3]，便可預(yù)測(cè)出11S球蛋白G2中A2鏈的13 個(gè)線性抗原表位，如表2所示。

表2 DNAStar預(yù)測(cè)的抗原表位結(jié)果Table 2 Epitopes predicted by DNAStar

2.3 SOPMA

SOPMA預(yù)測(cè)的11S球蛋白G2中A2鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖4所示，二級(jí)結(jié)構(gòu)中有22.30%的氨基酸殘基構(gòu)成α-螺旋，有19.42%的氨基酸殘基構(gòu)成β-折疊，有8.99%的氨基酸殘基構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角，而49.28%的氨基酸殘基屬于無規(guī)則卷曲處。由二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)理論可知，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲屬于抗原表位的優(yōu)勢(shì)區(qū)域[20]，根據(jù)上述結(jié)論預(yù)測(cè)出11S球蛋白G2中A2鏈的16 個(gè)線性抗原表位如表3所示。

圖4 SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 4 Results predicted by SOPMA

表3 SOPMA預(yù)測(cè)的抗原表位結(jié)果Table 3 Epitopes predicted by SOPMA

2.4 BepiPred

BepiPred 1.0 Server使用隱馬爾可夫模型和親水性參數(shù)評(píng)分預(yù)測(cè)出的10 個(gè)11S球蛋白G2中A2鏈的抗原表位結(jié)果如表4所示。

表4 BepiPred預(yù)測(cè)的抗原表位結(jié)果Table 4 Epitopes predicted by BepiPred

2.5 ABCpred

將11S球蛋白G2中A2鏈序列提交到ABCpred網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器后，利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)出了11S球蛋白G2中A2鏈的13個(gè)線性抗原表位，如表5所示。

表5 ABCpred預(yù)測(cè)的抗原表位結(jié)果Table 5 Epitopes predicted by ABCpred

2.6 11S球蛋白G2中A2鏈的B細(xì)胞線性抗原表位的綜合預(yù)測(cè)

綜合DNAStar、SOPMA、BepiPred和ABCpred四種軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，如圖5所示，4 種軟件均包含的表位分別是37KPDNRIE43、79PSYTNGP85、114SQQRGRSQRP123，這些表位最可能是11S球蛋白G2中A2鏈的線性表位。此外，由3種軟件預(yù)測(cè)的共有表位有52WNPNNK57、196QQGGSQSQKGKQQE209、241QGENEEED248、267RKPQQEEDDDDEEEQ281、287TDKGC291。這些表位成為11S球蛋白G2中A2鏈抗原表位的可能性也比較大，可作為研究重點(diǎn)。

圖5 DNAStar、SOPMA、BepiPred和ABCpred預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 5 Results predicted by DNAStar, SOPMA, BepiPred and ABCpred

2.7 DiscoTope 2.0 Server預(yù)測(cè)的構(gòu)象表位結(jié)果

圖6 DiscoTope 2.0 Server預(yù)測(cè)的構(gòu)象表位結(jié)果Fig. 6 Conformational epitopes predicted by DiscoTope 2.0 Server

圖7 11S球蛋白G2中A2鏈的構(gòu)象表位示意圖Fig. 7 Schematic diagram of conformational epitopes of the A2 chain of 11S globulin G2

DiscoTope服務(wù)器根據(jù)11S球蛋白G2中A2鏈的三維結(jié)構(gòu)，利用新的表位傾向的氨基酸評(píng)分和表面可及性預(yù)測(cè)得到的B細(xì)胞構(gòu)象表位如圖6所示，在蛋白三維結(jié)構(gòu)中構(gòu)象表位的示意圖如圖7所示?？梢园l(fā)現(xiàn)這些構(gòu)象表位的氨基酸殘基多位于無規(guī)則卷曲處。

3 結(jié) 論

本研究運(yùn)用NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)找到11S球蛋白G2中A2鏈的蛋白質(zhì)序列，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中找到目標(biāo)蛋白的同源蛋白，使用SWISS-MODEL、Deep View 4.1等對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行同源建模與穩(wěn)定性評(píng)估，使用DiscoTope 2.0 Server軟件預(yù)測(cè)B細(xì)胞構(gòu)象表位，通過預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)象表位多位于無規(guī)則卷曲處。綜合運(yùn)用DNAStar、SOPMA、BepiPred和ABCpred等生物信息學(xué)軟件對(duì)11S球蛋白G2中A2鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，這4種軟件基于不同的算法和數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)結(jié)果也不完全相同，僅僅通過一種軟件預(yù)測(cè)有較大的局限性，因此將其結(jié)果綜合分析以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率。最終定位了B細(xì)胞線性結(jié)合表位，有可能是11S球蛋白G2中A2鏈的線性表位有：37KPDNRIE43、79PSYTNGP85、114SQQRGRSQRP123、52WNPNNK57、196QQGGSQSQKGKQQE209、241QGENEEED248、267RKPQQEEDDDDEEEQ281、287TDKGC291。本研究縮小了檢測(cè)范圍，為后續(xù)的制肽、免疫等操作找出更準(zhǔn)確的肽序，為找出更準(zhǔn)確抗體來檢測(cè)食品中的大豆過敏原提供了便利。本研究將為后期開發(fā)適合檢測(cè)我國(guó)大豆過敏人群的食品大豆過敏檢測(cè)技術(shù)提供理論支持。