鲊廣椒真菌多樣性及其對(duì)滋味品質(zhì)影響的評(píng)價(jià)

王玉榮，代凱文，沈 馨，董 蘊(yùn)，周書(shū)楠，郭 壯,*

（1.湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.當(dāng)陽(yáng)市食品藥品監(jiān)督管理局，湖北 當(dāng)陽(yáng) 444100）

作為我國(guó)特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品，湖北宜昌地區(qū)制作的鲊廣椒以大米面、鮮紅辣椒和食鹽為主要原料，室溫下發(fā)酵15～20 d而成，具有酸辣適口、滋味鮮香的特點(diǎn)。鲊廣椒的發(fā)酵通常在倒扣于水盆的壇子中完成，同時(shí)壇口會(huì)塞入半壇稻草以防止原料浸入水中[1]。雖然發(fā)酵過(guò)程均在密封環(huán)境中完成[2]，但發(fā)酵初始階段壇中存在的一定量空氣，為專(zhuān)性好氧真菌的生長(zhǎng)提供了必要的氧氣。此外，鲊廣椒的制作環(huán)境相對(duì)開(kāi)放，加之環(huán)境中存在少量兼性厭氧和微好氧真菌，因而發(fā)酵好的鲊廣椒產(chǎn)品中存在一定量的真菌，而該部分真菌的存在可能會(huì)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)及使用安全性產(chǎn)生一定的影響，所以對(duì)鲊廣椒中真菌多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)是極為必要的。

以Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)為代表的第2代測(cè)序技術(shù)具有通量高和檢測(cè)速度快的特點(diǎn)[3]，通過(guò)為每個(gè)樣品在測(cè)序前加上一段被稱(chēng)作樣品特異性條形碼或者標(biāo)簽的核苷酸序列，實(shí)現(xiàn)了多樣本的平行實(shí)驗(yàn)[4]，解決了傳統(tǒng)指紋圖譜技術(shù)不能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的缺點(diǎn)[5]。近年來(lái)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于酸奶[6]、臘腸[7]、葡萄酒[8]、窖泥[9]和泡菜[10]等發(fā)酵食品微生物多樣性研究和特異菌種的檢測(cè)中，為全面和深入研究不同發(fā)酵食品基質(zhì)中微生物分子生態(tài)學(xué)提供了新的技術(shù)手段。電子舌實(shí)現(xiàn)了食品酸味、苦味、澀味、鮮味、咸味、甜味、苦味回味、澀味回味和鮮味回味的數(shù)字化評(píng)價(jià)，具有結(jié)果穩(wěn)定且受外界影響小的優(yōu)點(diǎn)[11]，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于米酒[12]、啤酒[13]、水產(chǎn)品[14]和醋[15]等發(fā)酵食品的滋味品質(zhì)評(píng)價(jià)中。

本研究從湖北省宜昌市當(dāng)陽(yáng)地區(qū)農(nóng)戶(hù)家中采集了10 個(gè)鲊廣椒樣品，首先采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其真菌微生物多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，繼而使用電子舌系統(tǒng)對(duì)各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，最終對(duì)真菌多樣性與鲊廣椒滋味品質(zhì)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析，以期對(duì)后續(xù)鲊廣椒產(chǎn)品品質(zhì)改良及安全性評(píng)價(jià)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲊廣椒采集自湖北省當(dāng)陽(yáng)市草埠湖鎮(zhèn)和玉泉辦事處10 個(gè)農(nóng)戶(hù)家。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit食品DNA基因組提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN公司；5×TransStartTMFastPfu Buffer、FastPfu Fly DNA Polymerase、dNTPs Mix北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 1000試劑盒美國(guó)Agilent公司；味覺(jué)標(biāo)準(zhǔn)溶液、陰離子和陽(yáng)離子溶液、內(nèi)部溶液及參比溶液 日本Insent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器 美國(guó)Dell公司；SA 402B電子舌（配備AAE、CT0、CA0、AE1、C00和GL1測(cè)試傳感器）日本Insent公司；2100芯片生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng)；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Nano Drop公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀 美國(guó)AB公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品微生物宏基因組DNA提取

取1.0 g鲊廣椒，參照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，檢測(cè)合格后的DNA樣品置-20 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 真菌18S rRNA V4～V5區(qū)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

正向引物為SSU0817F（5’-TTAGCATGGAA TAATRRAATAGGA-3’），反向引物為SSU1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）[16]，其中在正向引物中加入7 個(gè)核苷酸標(biāo)簽（barcode）。PCR擴(kuò)增體系為：4 μL 5×PCR緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs mix，0.8 μL 5 μmol/L正向引物，0.8 μL 5 μmol/L反向引物，0.4 μL 5 U/μL DNA聚合酶，10 ng DNA模板，體系用ddH2O補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.3.3 樣品平衡及MiSeq高通量測(cè)序

將10 個(gè)經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物按照100 nmol/L濃度進(jìn)行稀釋混勻后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。1.3.4 序列質(zhì)控

根據(jù)成對(duì)序列之間的重疊（overlap）關(guān)系，將下機(jī)的雙端序列數(shù)據(jù)拼接（merge）成一條序列。在序列拼接過(guò)程中根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)控：overlap區(qū)的堿基數(shù)需大于10 bp；最大錯(cuò)配比率需小于等于0.2；拼接好的序列需無(wú)barcode堿基錯(cuò)配；引物堿基錯(cuò)配數(shù)需小于等于2 bp。

序列拼接后，依照barcode信息將下機(jī)序列劃分到各樣品，對(duì)序列方向進(jìn)行校正后切掉barcode和引物，進(jìn)而得到高質(zhì)量的序列。若切掉barcode和引物后的序列其堿基數(shù)小于50 bp，則該序列亦予以切除。

1.3.5 生物信息學(xué)分析

質(zhì)控合格后的序列，采用QIIME（v1.70）平臺(tái)[17]進(jìn)行真菌微生物物種分析和多樣性評(píng)價(jià)[14]。主要的處理流程為：1）采用PyNAST校準(zhǔn)并把序列排齊[18]；2）首先在100%相似性下進(jìn)行UCLUST歸并[19]，建立無(wú)重復(fù)的單一的18S rRNA V4～V5區(qū)序列集，繼而在97.0%相似性下進(jìn)行序列歸并，構(gòu)建分類(lèi)操作單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣；3）應(yīng)用ChimeraSlayer去除含有嵌合體序列的OTU序列[20]；4）使用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)[21]進(jìn)行序列同源性比對(duì)，在門(mén)、綱、目、科和屬水平上對(duì)其分類(lèi)學(xué)地位進(jìn)行明確；5）使用FastTree軟件，繪制基于OTU代表序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[22]；6）采用發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)（Shannon-Wiener index）等α多樣性指標(biāo)分別對(duì)單個(gè)樣品真菌微生物的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)，采用稀疏曲線(xiàn)和香農(nóng)指數(shù)曲線(xiàn)對(duì)測(cè)序深度是否滿(mǎn)足后續(xù)分子生物學(xué)分析進(jìn)行評(píng)估[23]；7）分別基于UniFrac距離[24]進(jìn)行主坐標(biāo)分析和非加權(quán)組平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法聚類(lèi)分析，進(jìn)而完成不同樣品間真菌微生物的β多樣性分析。

1.3.6 核酸登錄號(hào)

本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為mgp81949。

1.3.7 基于電子舌技術(shù)鲊廣椒滋味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

稱(chēng)取10 g鲊廣椒樣品于190 mL蒸餾水中，3 000 r/min離心10 min后取上清液過(guò)濾，按照下述步驟對(duì)鲊廣椒樣品酸、苦、澀、咸、鮮等基本味及澀、苦和鮮味回味進(jìn)行測(cè)定[25]：1）將C00和AE1傳感器浸泡在陽(yáng)離子溶液中，CA0、CT0和AAE傳感器浸泡在陰離子溶液中，5 個(gè)傳感器浸泡時(shí)間均為90 s，以去除傳感器上的吸附物；2）5 個(gè)傳感器在參比溶液1和2中分別洗滌120 s后，在參比溶液3中浸泡30 s，測(cè)得參比溶液的電勢(shì)值Vr；3）5 個(gè)傳感器在某鲊廣椒樣品中浸泡30 s，測(cè)得電勢(shì)值Vs，通過(guò)計(jì)算Vs-Vr值即可得到樣品酸、苦、澀、咸和鮮味5 個(gè)基本味的相對(duì)強(qiáng)度值；4）傳感器C00、AE1和AAE于參比溶液4和5中分別洗滌3 s后，于參比溶液6中浸泡30 s，測(cè)得電勢(shì)Vr’，通過(guò)計(jì)算Vr’-Vr值即可得到樣品后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）的相對(duì)強(qiáng)度值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定4 次，選后3 次納入數(shù)據(jù)分析。

GL1傳感器在陰離子溶液中浸泡90 s后，參照上述程序單獨(dú)對(duì)鲊廣椒樣品的甜味進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5 次，選后3 次納入數(shù)據(jù)分析。

1.3.8 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用皮爾森相關(guān)性分析法對(duì)平均相對(duì)含量大于1.0%的真菌屬之間的相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算，并采用熱圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行展示；亦使用皮爾森相關(guān)性分析法對(duì)鲊廣椒中優(yōu)勢(shì)真菌屬和電子舌各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度之間的相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)選取相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.5的指標(biāo)，采用Cytoscape軟件（v3.5.1）進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖繪制。使用Origin 8.5軟件（OriginLab Corp，MA，USA）和R軟件（v3.3.2）進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

在提取鲊廣椒樣品宏基因組DNA的基礎(chǔ)上，本研究采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)鲊廣椒樣品中真菌微生物多樣性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。樣品18S rRNA測(cè)序情況及各分類(lèi)地位數(shù)量如表1所示。

表1 樣品18S rRNA測(cè)序情況及各分類(lèi)地位數(shù)量Table 1 18S rRNA read counts and number of identifiable units at different taxonomical levels

由表1可知，10 個(gè)鲊廣椒樣品共產(chǎn)生了376 256 條高質(zhì)量的18S rRNA序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生37 626 條。本研究采用兩步UCLUST法進(jìn)行OTU的劃分，根據(jù)序列100%相似性聚類(lèi)分析后，得到69 496 條代表性序列，繼而經(jīng)過(guò)序列97.0%相似性聚類(lèi)分析后，得到5 457 個(gè)OTU，經(jīng)嵌合體檢查后去除14 個(gè)OTU，還剩余5 443 個(gè)OTU進(jìn)行后續(xù)分析。本研究有18.45%的OTU和3.91%的序列（范圍為0%～14.11%，標(biāo)準(zhǔn)差為5.15%）不能鑒定到屬水平。

采用稀疏曲線(xiàn)和香農(nóng)指數(shù)曲線(xiàn)，本研究進(jìn)一步對(duì)現(xiàn)有測(cè)序深度是否滿(mǎn)足后續(xù)分子生物學(xué)分析進(jìn)行了評(píng)估，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 稀疏曲線(xiàn)圖（A）和香農(nóng)指數(shù)圖（B）Fig. 1 Rarefaction analysis (A) and Shannon diversity estimates (B)

由圖1可知，隨著測(cè)序深度的增加，鲊廣椒樣品中發(fā)現(xiàn)真菌物種數(shù)的數(shù)量亦隨之增大且稀疏曲線(xiàn)尚未進(jìn)入平臺(tái)期，而香農(nóng)指數(shù)曲線(xiàn)已完全達(dá)到平衡狀態(tài)。由此可見(jiàn)，隨著測(cè)序深度的增加雖然有新的真菌種系型可能被發(fā)現(xiàn)，但本研究已經(jīng)完全捕獲到了鲊廣椒樣品中真菌類(lèi)群的多樣性信息，因而本研究的測(cè)序深度可以滿(mǎn)足后續(xù)生物信息學(xué)分析要求[26]。

2.2 基于各分類(lèi)學(xué)地位相對(duì)含量的鲊廣椒真菌微生物構(gòu)成分析

在門(mén)水平上，鲊廣椒樣品中微生物主要隸屬于7 個(gè)真菌門(mén)，其中Ascomycota（子囊菌門(mén)）的平均相對(duì)含量高達(dá)99.97%。在屬水平上，共發(fā)現(xiàn)135 個(gè)真菌屬，鲊廣椒中優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)含量的比較分析如圖2所示。

圖2 鲊廣椒中優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)含量的比較分析Fig. 2 Relative abundances of the major fungal genera in Zhaguangjiao samples

由圖2可知，鲊廣椒中隸屬于Ascomycota（子囊菌門(mén)）且平均相對(duì)含量大于1.0%的真菌屬及其相對(duì)含量分別為：Candida（念珠菌屬，56.63%）、Eurotium（曲霉菌屬，10.12%）、Pichia（畢赤酵母屬，11.19%）、Fusarium（鐮刀霉屬，2.67%）、Galactomyces（地霉屬，2.48%）、Cladosporium（分枝孢子菌屬，2.21%）和Debaryomyces（德巴利氏酵母屬，1.01%）。此外，還有隸屬于Basidiomycota（擔(dān)子菌門(mén)）的Guehomyces（久浩酵母屬），其平均相對(duì)含量為1.50%。由此可見(jiàn)，當(dāng)陽(yáng)地區(qū)鲊廣椒主要是由若干個(gè)隸屬于Ascomycota（子囊菌門(mén)）已知的優(yōu)勢(shì)真菌屬組成，其平均累計(jì)含量為86.32%。Candida（念珠菌屬）和Pichia（畢赤酵母屬）在10 個(gè)樣品中均存在，其平均累計(jì)含量分別為67.82%。平均相對(duì)含量大于1.0%的真菌屬相關(guān)性的熱圖如圖3所示。

由圖3可知，Galactomyces（地霉屬）與Candida（念珠菌屬）呈顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.673，P＜0.05），與Eurotium（曲霉菌屬）呈極顯著正相關(guān)（R=0.893，P＜0.01），Guehomyces（久浩酵母屬）與Fusarium（鐮刀霉屬）呈極顯著正相關(guān)（R=0.867，P＜0.01），Debaryomyces（德巴利氏酵母屬）與Fusarium（鐮刀霉屬，R=0.667）和Guehomyces（久浩酵母屬，R=0.719）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。本研究進(jìn)一步在OTU水平上對(duì)鲊廣椒真菌微生物的多樣性進(jìn)行分析，OTU在10 個(gè)樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計(jì)如圖4所示。

圖3 平均相對(duì)含量大于1.0%的真菌屬相關(guān)性的熱圖Fig. 3 Heat map of correlation among the fungal genera with relative abundances more than 1.0%

圖4 OTU在10 個(gè)樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig. 4 Distribution of OTU as a function of their prevalence in the 10 samples

由圖4可知，納入本研究的樣品共產(chǎn)生5 443 個(gè)OTU，然而在10 個(gè)樣品中僅出現(xiàn)1 次的OTU有4 715 個(gè)，占OTU總數(shù)的86.63%，所包含序列數(shù)為13 070 條，僅占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的3.47%。10 個(gè)樣品沒(méi)有共有的OTU，僅有5 個(gè)OTU存在9 個(gè)樣品中，其包含序列數(shù)為203 208 條，高達(dá)所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的54.01%。由此可見(jiàn)，在OTU水平上，雖然若干鲊廣椒樣品存在大量的核心真菌菌群，但某些樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的構(gòu)成存在較大差異。

2.3 基于多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的鲊廣椒真菌微生物構(gòu)成分析

通過(guò)上述分析，本研究發(fā)現(xiàn)雖然多數(shù)鲊廣椒樣品存在大量的核心真菌菌群，但某些樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的構(gòu)成存在較大差異，因而本研究進(jìn)一步采用基于OTU水平的加權(quán)UniFrac距離主坐標(biāo)分析和UPGMA聚類(lèi)分析，對(duì)10 個(gè)鲊廣椒樣品的β多樣性進(jìn)行了分析，基于分類(lèi)操作單元的加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析如圖5所示。

圖5 基于分類(lèi)操作單元的加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析Fig. 5 Principal coordinate analysis of OTUs based on weighted UniFrac distance

由圖5可知，10 個(gè)鲊廣椒樣品呈現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)，其中DY1、DY2、DY5和DY8，DY4、DY6、DY7和DY9，DY3和DY10分別呈現(xiàn)出聚類(lèi)趨勢(shì)。基于分類(lèi)操作單元的加權(quán)UniFrac距離的UPGMA聚類(lèi)分析如圖6所示。

圖6 基于分類(lèi)操作單元的加權(quán)UniFrac距離的UPGMA聚類(lèi)分析Fig. 6 UPGMA clustering analysis of OTUs based on weighted UniFrac distance

由圖6可知，10 個(gè)樣品整體上可以分為3 個(gè)聚類(lèi)，其中聚類(lèi)I由樣品DY4、DY6、DY7和DY9構(gòu)成，聚類(lèi)II由樣品DY1、DY2、DY5和DY8構(gòu)成，聚類(lèi)III由DY3和DY10構(gòu)成，這與基于分類(lèi)操作單元的加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析結(jié)果一致，亦進(jìn)一步證實(shí)了雖然若干鲊廣椒樣品存在大量的核心真菌菌群，但某些樣品間其微生物群落結(jié)構(gòu)構(gòu)成存在較大的差異。通過(guò)Krushkal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隸屬于不同聚類(lèi)的樣品除Eurotium（曲霉菌屬）和Guehomyce（久浩酵母屬）外，其他優(yōu)勢(shì)真菌屬差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 鲊廣椒優(yōu)勢(shì)真菌屬及滋味品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

圖7 鲊廣椒各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度值的箱形圖（n=10）Fig. 7 Box plot of relative intensity of each taste index (n = 10)

在采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)真菌微生物多樣性進(jìn)行揭示的基礎(chǔ)上，使用電子舌對(duì)鲊廣椒樣品的滋味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了優(yōu)勢(shì)真菌屬與產(chǎn)品滋味品質(zhì)相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖。鲊廣椒各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度值的箱形圖如圖7所示。

由圖7可知，鲊廣椒樣品在酸味上的差異最大，其次為咸味、甜味和鮮味，而在苦味、澀味、后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）指標(biāo)上的差異較小。鲊廣椒優(yōu)勢(shì)真菌屬和滋味物質(zhì)相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖如圖8所示。

圖8 鲊廣椒優(yōu)勢(shì)真菌屬和滋味物質(zhì)相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 8 Correlation network diagram of major fungal genera and taste attributes in Zhaguangjiao samples

由圖8可知，Pichia（畢赤酵母屬）與鲊廣椒苦味呈正相關(guān)；Debaryomyces（德巴利氏酵母屬）和Guehomyce（久浩酵母屬）與鲊廣椒澀味呈正相關(guān)；Debaryomyces（德巴利氏酵母屬）、Galactomyces（地霉屬）和Eurotium（曲霉菌屬）與鲊廣椒后味A（澀味的回味）呈正相關(guān)；Galactomyces（地霉屬）與后味B（苦味的回味）呈正相關(guān)?？辔丁?、后味A和后味B均為鲊廣椒的缺陷型指標(biāo)，由此可見(jiàn)，優(yōu)勢(shì)真菌屬多與鲊廣椒品質(zhì)的缺陷性指標(biāo)相關(guān)，真菌含量過(guò)高可能不利于產(chǎn)品滋味品質(zhì)的形成。

3 討 論

近年來(lái)出現(xiàn)的以Illumina MiSeq為代表的第2代高通量測(cè)序技術(shù)可以全面、客觀、無(wú)偏地了解某一微生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)，具有通量高、檢測(cè)速度快和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)[27]。本研究采用該技術(shù)對(duì)當(dāng)陽(yáng)地區(qū)鲊廣椒中真菌微生物多樣性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)念珠菌屬、曲霉菌屬和畢赤酵母屬為其優(yōu)勢(shì)真菌屬，相對(duì)含量占到了真菌數(shù)的近八成。念珠菌是真菌中最常見(jiàn)的條件致病菌，曲霉菌屬亦是引起多種物質(zhì)霉腐的主要微生物之一，且鲊廣椒樣品中亦存在隸屬于鐮刀菌屬、地霉屬和分枝孢子菌屬的腐敗真菌[28]。制作鲊廣椒的發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，然而發(fā)酵初始階段壇中存在的空氣及發(fā)酵后期居民常開(kāi)壇取食鲊廣椒，均為真菌的生長(zhǎng)提供了必需的氧氣，使鲊廣椒受腐敗真菌污染的機(jī)率大大增加。此外，制作鲊廣椒的壇子常倒扣于水盆中并置于墻角或房檐下，用于密封的水亦常因家禽飲用或雨水濺入而發(fā)臭，這也增加了鲊廣椒被腐敗真菌污染的機(jī)會(huì)。由此可見(jiàn)，改善鲊廣椒加工環(huán)境進(jìn)而抑制腐敗霉菌的生長(zhǎng)，對(duì)保障鲊廣椒的食用安全性具有積極的意義。

在采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)真菌微生物多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，本研究使用電子舌系統(tǒng)對(duì)各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鲊廣椒樣品在酸味上的差異最大，這可能與樣品中乳酸菌含量不同有關(guān)[29]，因?yàn)槌婢怊噺V椒中亦存在大量細(xì)菌。此外，通過(guò)將真菌多樣性與鲊廣椒滋味品質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)真菌屬多與鲊廣椒品質(zhì)的缺陷性指標(biāo)相關(guān)，因而綜上所述，當(dāng)陽(yáng)地區(qū)鲊廣椒中真菌微生物主要隸屬于念珠菌屬、曲霉菌屬和畢赤酵母屬，且其含量過(guò)高可能不利于產(chǎn)品滋味品質(zhì)的形成。此外，MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)存在讀長(zhǎng)短的缺陷，因而二代測(cè)序只能在屬的水平上研究樣本中菌群的組成和變化，難以精確到種水平上[30]，因而在后續(xù)研究中積極引入新的測(cè)序技術(shù)并實(shí)現(xiàn)鲊廣椒樣品中活的真菌的絕對(duì)定量，對(duì)鲊廣椒產(chǎn)品品質(zhì)改良及安全性評(píng)價(jià)將具有積極的意義。