基于定向進(jìn)化技術(shù)提高巨大芽孢桿菌谷氨酸脫羧酶活性

趙云飛，邵澤香，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）是一種磷酸吡哆醛（pyridoxal 5’-phosphate，PLP）類(lèi)酶，是生物合成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的關(guān)鍵酶[1]。而GABA作為一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)[2]，不僅對(duì)于人體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、調(diào)節(jié)血壓、治療精神疾病、抗衰老等諸多方面發(fā)揮了重要作用[3-10]，而且能夠活化肝腎功能，促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌，具有優(yōu)良的保健功能[11-15]，因而開(kāi)發(fā)含有GABA的功能性保健品具有非常良好的經(jīng)濟(jì)前景。GAD分布廣泛，從單細(xì)胞有機(jī)體到高級(jí)哺乳動(dòng)物有機(jī)體中均有GAD，但一般含量很低，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)。而利用微生物來(lái)源的GAD催化L-谷氨酸鈉（L-sodium glutamate，L-MSG）生產(chǎn)GABA，不受資源、環(huán)境和空間的限制，這使之成為生產(chǎn)GABA研究的熱點(diǎn)。但目前生產(chǎn)GABA的關(guān)鍵酶GAD普遍只能在酸性環(huán)境中發(fā)揮作用，在酶促反應(yīng)的過(guò)程中不斷消耗H＋導(dǎo)致pH值上升，但是由于在偏中性的條件下酶活性低、穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)而難以應(yīng)用于生產(chǎn)。

為了提高GAD活性，通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段對(duì)GAD進(jìn)行酶分子水平的改造是常用的手段。進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造主要是對(duì)酶分子進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和非理性設(shè)計(jì)（定向進(jìn)化）等[16]。最新的研究中，Shi Feng等[17]為提高棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）Lb85表達(dá)的GAD在偏中性條件下的酶活性，通過(guò)易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的條件得到突變株T17I、D294G，能夠大幅提高偏中性環(huán)境的酶活性；Lin Ling等[18]通過(guò)對(duì)短乳桿菌（Lactobacillus breris）編碼的GAD基因進(jìn)行定向進(jìn)化，得到突變株Q51H可以提高GAD最適pH值條件下的酶活性。但就目前而言，有關(guān)研究GAD分子改造方面的研究甚少，國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用定向進(jìn)化技術(shù)改造巨大芽孢桿菌谷氨酸脫羧酶的相關(guān)研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室在前期對(duì)于GAD的研究中，從土壤中篩選到一株產(chǎn)GABA的菌株，經(jīng)鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），其GAD基因?yàn)橐欢稳碌男蛄?，尚鮮見(jiàn)報(bào)道。然而該基因表達(dá)的GAD活性較低，極大地限制了其在工業(yè)上生產(chǎn)GABA的廣泛應(yīng)用。為了提高巨大芽孢桿菌GAD活性，本研究采用易錯(cuò)PCR技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，以期可以獲得酶活性顯著提高的突變體，為GAD可以工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pET30a（＋）-GAD重組質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。限制性內(nèi)切酶SacI與XhoI 大連寶生物公司；2×Taq PCR Mixture、卡納青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

5840R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；JY98-III超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝科學(xué)儀器研究所；PTC-100TMPCR儀美國(guó)MJ Research公司；PowPacTM高電流電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；JS-380C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像儀上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)的構(gòu)建

以pET30a（＋）-GAD重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為含有SacI酶切位點(diǎn)（下劃線）上游引物（5’-CGAGCTCATGCCTCAATGGCACCCG-3’）、含有XhoI酶切位點(diǎn)（下劃線）的下游引物（5’-GCTCGAG TTAATGATGAAATCCATTGTCGTATTTC-3’）。每50 μL反應(yīng)體系為：5 μL 10×易錯(cuò)PCR緩沖液；14 μL Mg2＋（25 mmol/L）；4 μL dNTP（2.5 mmol/L dGTP、2.5 mmol/L dCTP、2.5 mmol/L dATP、2.5 mmol/L dTTP混合溶液）；1 μL上游引物（10 pmol/L）、1 μL下游引物（10 pmol/L）、3 μL MnCl2溶液（5 mmol/L）、1 μL質(zhì)粒模板、Taq DNA聚合酶5 U，最后加入高溫滅菌的超純水至總體積為50 μL。將第1輪易錯(cuò)PCR的有益突變質(zhì)粒作為新1輪模板進(jìn)行第2輪的易錯(cuò)PCR。易錯(cuò)PCR程序?yàn)?5 ℃變性5 min后進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，然后95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環(huán)30 次，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI、XhoI進(jìn)行酶切。酶切后PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化回收，純化后的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物與同樣酶切處理后的pET-30a表達(dá)載體進(jìn)行連接。連接后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建隨機(jī)誘變文庫(kù)。

1.3.2 突變體文庫(kù)的誘導(dǎo)表達(dá)

通過(guò)易錯(cuò)PCR構(gòu)建的突變體文庫(kù)，采用96 微孔板法進(jìn)行表達(dá)。參考Guo Fangfang等[19]建立的重組大腸桿菌產(chǎn)天冬酰胺酶的高通量篩選方法，過(guò)程稍作修改。篩選方法為：從LB-卡納青霉素平板上挑取單菌落，接種于96孔板，每孔含有500 μL LB（50 μg/mL卡納青霉素）培養(yǎng)基，以pET30a（＋）-GAD轉(zhuǎn)化子作為對(duì)照；37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h后，將50 μL菌液接種于另一含有600 μL LB（50 μg/mL卡納青霉素）培養(yǎng)基的96孔板中；37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至其OD600nm達(dá)到0.6～0.8，加入IPTG至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL；16 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。離心收集菌體，用150 μL質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL溶菌酶的磷酸緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7）重懸，37 ℃反應(yīng)30 min，然后反復(fù)凍融3 次以達(dá)到破碎細(xì)胞的目的，4 000 r/min離心10 min后，所得上清液即為粗酶液。

1.3.3 GAD突變體文庫(kù)的初篩

文庫(kù)篩選采用Yu Kai等[20]公開(kāi)的高通量篩選方法，篩選在96 孔板內(nèi)進(jìn)行，篩選過(guò)程作一定的修改以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件的需要。在96 孔表達(dá)板中，每孔含有200 μL 50 mmol/L的醋酸緩沖液（包含的50 mmol/L溴甲酸紫、0.04 mmol/L的PLP，pH 5），然后向每孔加入10 μL 1 mmol/L的L-MSG磷酸鹽溶液（pH 5），混合均勻后，置于45 ℃保溫10 min，然后快速向每孔加入10 μL粗酶液，于45 ℃反應(yīng)15 min，觀察每孔內(nèi)顏色的變化。溴甲酚紫在pH 5.0～6.8的范圍內(nèi)，由黃色變?yōu)樽仙?，如果指示劑的顏色由黃色變成紫色，則表示具有GAD活性，相同時(shí)間內(nèi)顏色變化越明顯表示酶活性越高。

1.3.4 酶的表達(dá)與純化

將初篩酶活性顯示提高的突變體接種于LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡納青霉素）中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按照1%接種量接種于另一LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡納青霉素）中，培養(yǎng)至其OD600nm值為0.6～0.8，加入IPTG（終質(zhì)量濃度為100 μg/mL），16 ℃誘導(dǎo)18 h左右。將培養(yǎng)好的菌體離心，棄掉上清液，用50 mmol/L的PBS（含0.5%的Triton 100，pH 7.0）重懸菌體，超聲破碎。破碎液離心取上清液即為粗酶液。重組pET30a-GAD表達(dá)過(guò)程中蛋白N端帶有組氨酸標(biāo)簽，因此使用鎳柱對(duì)野生型和突變型酶進(jìn)行純化。蛋白純化之后采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[21]，純酶使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的分析。

1.3.5 酶活性的測(cè)定

取10 μL純化后的酶液，加入到45℃預(yù)熱的490 μL底物溶液中（0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液，含0.04 mmol/L的PLP，100 mmol/L的L-MSG溶液，pH 5）。迅速混勻后在45 ℃反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速放入沸水浴終止反應(yīng)。采用高效液相色譜法測(cè)定反應(yīng)生成的GABA的含量，以測(cè)定突變酶的活力。在同樣條件下，以野生型GAD的反應(yīng)作為對(duì)照。酶活力單位：在測(cè)定條件下每分鐘生成1 μmol GABA所需的酶定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.3.6.1 酶促反應(yīng)的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

酶促反應(yīng)最適溫度測(cè)定：將純化后的酶液及底物溶液置于20～75 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)測(cè)定酶活性。溫度穩(wěn)定性的測(cè)定：將酶液置于4～55 ℃溫度范圍內(nèi)處理12 h，以處理0 h酶活性作為100%，測(cè)定殘余酶活性。并且將酶液在55 ℃熱處理過(guò)程中間隔2 h取樣，測(cè)定野生型及突變酶的半衰期。每次反應(yīng)在相同條件下設(shè)置3 個(gè)平行，然后以平均值作為該條件下的酶活性。

1.3.6.2 酶促反應(yīng)的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

最適反應(yīng)pH值的測(cè)定：設(shè)置不同pH值范圍的底物溶液（pH 3～6），45 ℃反應(yīng)5 min測(cè)定酶活性。pH值穩(wěn)定性的測(cè)定：將酶液置于不同pH值范圍內(nèi)處理12 h（pH 3～7），測(cè)定殘余酶活性。

1.3.6.3 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定

在不同濃度的底物溶液（L-MSG濃度5～100 mmol/L），加入過(guò)量的純酶液，最適條件下進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定GAD的活性，通過(guò)Lineweaver-Burk作圖法計(jì)算Km和Kcat。

1.3.6.4 三維結(jié)構(gòu)模擬及分析

將野生型氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器模擬其三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用PYMOL軟件分析氨基酸殘基之間的相互作用及突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.6.5 突變酶圓二色譜分析

將純化后的野生型和突變型酶液溶解于10 mmol/L PBS（pH7.0）中，在190～260 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。以10 mmol/L PBS（pH 7.0）作為空白，分析野生型與突變型酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理與圖像分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin軟件進(jìn)行作圖分析，蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬需要提交到SWISS-MODEL進(jìn)行模擬，三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果圖像采用PYMOL軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變文庫(kù)的高通量篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)兩輪易錯(cuò)PCR，庫(kù)容量達(dá)到13 000以上，從結(jié)果上來(lái)看，有5 株突變體表現(xiàn)出比野生型更高的酶活性（表1）。并且得到酶活性最高的突變體A5-3，酶活性是野生型的3.10 倍，其中氨基酸突變2 個(gè)位點(diǎn)，分別為A55D、D451E。

表1 野生型酶和易錯(cuò)PCR突變酶活性和氨基酸突變Table 1 GAD activity of the wild-type strain and mutants generated from epPCR

將酶活性最高的突變體A5-3、E2-4、E3-11進(jìn)行蛋白純化，得到其蛋白酶的比活力，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 野生型酶和易錯(cuò)PCR突變酶活性和氨基酸突變Table 2 GAD activity of the wild-type strain and mutants generated from epPCR

2.2 野生型酶與突變酶的純化結(jié)果

將野生型酶和突變酶表達(dá)純化后，通過(guò)SDS-PAGE分析（圖1），目的條帶均在50 kDa左右，與理論值53 kDa相符。

圖1 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE analysis of wild-type and mutant enzymes

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

取10 μL重組酶與490 μL濃度為100 mmol/L的L-MSG混勻，在20～75 ℃反應(yīng)5 min，然后迅速放入沸水浴中10 min滅活終止反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。E3-11最適反應(yīng)溫度與野生型相同，均為45 ℃；而A5-3與E2-4最適反應(yīng)溫度為55 ℃，高于野生型。

圖2 野生型酶和突變酶最適反應(yīng)溫度Fig. 2 Effects of temperature on the activity of wild-type and mutant enzymes

將野生型酶與突變酶置于4～55 ℃保溫12 h測(cè)定殘余酶活性，以沒(méi)有處理組酶活性作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)溫度高于30 ℃后E2-4的殘余酶活性高于野生型，A5-3的殘余酶活性與野生型大致相當(dāng)，而E3-11則明顯低于野生型。并選擇55 ℃研究野生型及突變體的半衰期。

圖3 野生型酶和突變酶的溫度穩(wěn)定性Fig. 3 Thermal stability of wild-type and mutant enzymes

將野生型酶和突變體置于55 ℃保溫，每2 h進(jìn)行取樣測(cè)殘余酶活性，測(cè)定野生型和突變體的半衰期。結(jié)果見(jiàn)表3。突變體A5-3與野生型溫度穩(wěn)定性無(wú)較大變化；E2-4的半衰期為21.92 h，高于野生型，說(shuō)明穩(wěn)定性有所改善；而E3-11半衰期為10.81 h，低于野生型，說(shuō)明E3-11的穩(wěn)定性有所下降。

表3 野生型酶和突變酶熱穩(wěn)定性Table 3 Thermal stability of wild-type and mutant enzymes

2.3.2 酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

配制不同pH值的底物-緩沖液溶液（pH 2～6），測(cè)定在不同pH值條件下GAD的活性，結(jié)果如圖4所示。突變體E2-4與野生型的最適pH值相同，而A5-3與E3-11的最適pH值相較于野生型往中性pH值條件偏移，其中A5-3的最適pH值為5。但是在pH值大于5的條件下野生型與突變體的酶活性均急劇下降，尤其A5-3酶活性下降的最快，說(shuō)明GAD為一種酸性酶，H＋的濃度嚴(yán)重影響酶活性。

圖4 野生型酶與突變酶的最適反應(yīng)pH值Fig. 4 Effects of pH on the activity of wild-type and mutant enzymes

野生型酶與突變酶在不同pH值緩沖液（pH 3～7）的條件下保存12 h，測(cè)定殘余酶活性，相對(duì)酶活性如圖5所示。相較于野生型，突變體A5-3、E2-4、E3-11在pH值大于4.5的條件下具有更好的pH值穩(wěn)定性。表明在偏中性的條件下，突變體更容易得到應(yīng)用，能夠承受偏中性條件的發(fā)酵環(huán)境。

圖5 野生型酶和突變酶pH值穩(wěn)定性Fig. 5 pH stability of wild-type and mutant enzymes

2.3.3 酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表4 野生型酶與突變酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 4 Kinetic parameters of wild-type and mutant enzymes

如表4所示，突變體A5-3、E2-4的Km值相較于野生型均略有下降，E3-11的Km值略高于野生型，但大致相同，說(shuō)明酶對(duì)底物的親和力并沒(méi)有太大變化；突變酶的Kcat/Km值都高于野生型，表明其催化活力有所提高。

2.3.4 三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果及分析

為探明E2-4、A5-3、E3-11酶活性提高的原因，構(gòu)建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，從氨基酸殘基之間的相互作用及空間結(jié)構(gòu)發(fā)生的改變進(jìn)行解析。目前微生物來(lái)源的GAD，只有源于大腸桿菌的GAD得到了晶體解析。而源于巨大芽孢桿菌的GAD三維結(jié)構(gòu)尚未解析，所以將野生型的基因序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器中，通過(guò)對(duì)PDB庫(kù)內(nèi)現(xiàn)有的GAD三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬（圖6A、B），相似度達(dá)到70%以上。巨大芽孢桿菌酶活性中心位點(diǎn)為279位的Lys，位于GAD內(nèi)部的無(wú)規(guī)則卷曲處，此位點(diǎn)結(jié)合PLP進(jìn)行催化反應(yīng)；同時(shí)88位Asp直接參與催化反應(yīng)，為反應(yīng)提供必需的H＋，因此該位點(diǎn)嚴(yán)格保守。突變體主要的突變位點(diǎn)在55位的Ala、34位的Leu、325位的Ala，位點(diǎn)突變后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化見(jiàn)圖6C～F。由圖6可知，34位的Leu位于蛋白結(jié)構(gòu)的一段無(wú)規(guī)則卷曲處，突變成Gln后酰胺鍵的存在一定程度上加強(qiáng)了這一部位的剛性，一定程度上提高了其穩(wěn)定性，而且34位的Leu位于蛋白結(jié)構(gòu)的表面，突變成親水的Gln使結(jié)構(gòu)變得更加合理；第55位的Ala位于GAD的一條α-螺旋臂上，并且遠(yuǎn)離活性中心，突變成了Asp之后，Asp不僅可以極大地增強(qiáng)供H＋能力，而且可以形成氫鍵，很可能與51位的His形成了氫鍵，進(jìn)而改變附近無(wú)規(guī)則卷曲的柔性，且His擁有儲(chǔ)存H＋能力，一旦催化反應(yīng)消耗掉H＋可以得到快速的補(bǔ)充，從而加快了酶的催化反應(yīng)；325位的Ala位于內(nèi)部的一條α-螺旋臂上，遠(yuǎn)離活性中心，突變成Ser，雖然一定程度上提高了催化反應(yīng)，但是很可能增加了酶的柔性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶本身的穩(wěn)定性下降。

圖6 巨大芽孢桿菌谷氨酸脫羧酶三維結(jié)構(gòu)建模Fig. 6 3D protein structure models of GAD from Bacillus megaterium

2.3.5 突變酶的圓二色譜分析

表5 突變酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例Table 5 Proportions of secondary structures in mutant enzymes

在圓二色譜儀中190～260 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定蛋白質(zhì)的橢圓率[22]，對(duì)突變酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量進(jìn)行分析。由表5可知，與野生型相比，3 個(gè)突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化不大，E2-4的α-螺旋含量略有增加，說(shuō)明溫度穩(wěn)定性所有提高；A5-3、E2-4、E3-11的無(wú)規(guī)則卷曲均有增加。研究表明，無(wú)規(guī)則卷曲的增加提高了蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)，不利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定[23-25]，而α-螺旋能夠維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[26]，這在一定程度上解釋了熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果。

3 討 論

目前有關(guān)來(lái)源于微生物的GAD的研究，主要集中于新基因的挖掘以及針對(duì)酶催化活性的分子改造。研究者經(jīng)過(guò)研究，進(jìn)一步闡述了GAD的作用機(jī)制，其中N端序列的氨基酸主要與GAD的空間分布有關(guān)，研究者[27-28]通過(guò)設(shè)計(jì)N端缺失體與野生型比較，發(fā)現(xiàn)在酸性pH值中N端缺失體在胞質(zhì)內(nèi)的分布有了顯著提高。但這一部分的研究仍然不是十分明確，例如Shi Feng等[17]的研究源于谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）的GAD發(fā)現(xiàn)突變株T17I仍然能夠顯著提高酶活性，并且擴(kuò)展GAD有效的pH值范圍；另外在第300位左右的氨基酸殘基會(huì)形成一個(gè)β發(fā)夾環(huán)，這個(gè)區(qū)域在不同pH值條件下會(huì)有不同的構(gòu)象，對(duì)酶促反應(yīng)起到了“開(kāi)關(guān)”作用，在中性pH值條件下，β發(fā)夾環(huán)與C端區(qū)域的幾個(gè)氨基酸殘基相互作用，改變了活性中心的構(gòu)象，嚴(yán)重影響了酶促反應(yīng)。而且在中性pH值條件下，PLP也很容易與活性位點(diǎn)解離，C末端延伸到活性中心并與活性位點(diǎn)結(jié)合，擋住底物入口，阻止底物與活性位點(diǎn)結(jié)合，極大地降低了酶活性[20]。因此有研究者[20]通過(guò)替換β環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)、C末端結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸殘基擴(kuò)展GAD在偏中性條件下的酶活性，收到了很好的效果，但仍存在很大的局限性。Yu Kai等[20]對(duì)源于Lactobacillus breris的GAD活性中心研究闡明，Phe65與Thr215形成了疏水的底物入口，PLP與活性中心Lys279的形成共價(jià)的希夫堿結(jié)構(gòu)；Asp88、Asp248是活性中心高度保守的殘基，在催化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用；另外，His278、Ser127以及PLP磷酸基團(tuán)附近的螺旋在維持的位置和正確取向方面也有著重要的意義。在更多有關(guān)GAD分子改造方面的研究也主要集中于提高GAD在偏中性條件下的酶活性，如Shi Feng等[17]研究得到的突變株E312S能夠極大地改善偏中性條件下的酶活性，但是仍然存在酶活性低、穩(wěn)定性差、難以得到實(shí)際應(yīng)用的缺點(diǎn)。

本研究在實(shí)驗(yàn)室發(fā)掘到來(lái)源于巨大芽孢桿菌新的GAD基因的基礎(chǔ)上，運(yùn)用易錯(cuò)PCR策略對(duì)GAD基因進(jìn)行改造，從13 000 多個(gè)突變株中得到了3 株酶活性提高的菌株A5-3、E2-4、E3-11，突變酶的比活力比野生型分別提高了157%、115%、97%，最優(yōu)突變體A5-3酶比活力達(dá)到（143.27±1.28）U/mg，且動(dòng)力學(xué)研究表明，突變位點(diǎn)對(duì)酶的Km影響較小，但對(duì)Kcat影響較大，突變酶A5-3的Kcat/Km為17.29 L/（mmol·s），較野生型提高了152%，說(shuō)明該突變酶的催化活性大幅提高，該結(jié)果優(yōu)于Shi Feng[17]、Lin Ling等[18]定向進(jìn)化后突變酶的催化效率。

為了探明突變酶活性提高的原因，將野生型的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL，得其三維結(jié)構(gòu)。突變體A5-3在55位發(fā)生了突變，此位點(diǎn)由Ala突變成Asp，由三維結(jié)構(gòu)模擬可知，此位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的α-螺旋上，離活性中心較遠(yuǎn)。GAD作為一種酸性酶，反應(yīng)中H＋是必需的底物，但是在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，由于反應(yīng)不斷消耗掉H＋，因而始終處于缺H＋的狀態(tài)。Asp作為一種酸性氨基酸，其等電點(diǎn)為pH 2.77，在pH值大于2.77的條件下以質(zhì)子化的形式存在，偏酸性條件下就可以解離出H＋，參與酸堿催化反應(yīng)，且側(cè)鏈短，親水性強(qiáng)，易形成氫鍵[29]，很可能與51位的His形成氫鍵，進(jìn)而影響周?chē)慕Y(jié)構(gòu)，且His擁有儲(chǔ)存H＋能力，His的pKa值接近生理pH值，所以蛋白內(nèi)的組氨酸一般都是保守的。Asp55與His51的這種聯(lián)系很可能形成了一種供H＋“通道”，一旦催化反應(yīng)消耗掉H＋就可以得到快速補(bǔ)充，從而加快酶的催化反應(yīng)。將此位點(diǎn)定點(diǎn)突變成同為酸性氨基酸的Glu，亦得到了酶活性提高的突變體，說(shuō)明該位點(diǎn)確實(shí)與酶促反應(yīng)中H＋的供應(yīng)有關(guān)。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)角度看，疏水相互作用主要是影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵，是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中的最重要因素[30]，有研究者通過(guò)系統(tǒng)分析22 個(gè)蛋白質(zhì)中和疏水相互作用有關(guān)的148 個(gè)突變體發(fā)現(xiàn)，疏水相互作用對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)約為（60±4）%，而氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)約為（40±4）%，這表明疏水相互作用是蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中最重要的驅(qū)動(dòng)力[31-32]。突變體E2-4在34位由Leu突變成Gln，由模擬結(jié)果可知，此位點(diǎn)位于N端區(qū)域，這一區(qū)域是一段無(wú)規(guī)則卷曲，構(gòu)象極具柔性，目前的研究結(jié)構(gòu)顯示N端區(qū)域主要與GAD在胞質(zhì)中的分布有關(guān)，但是對(duì)于其全部生理功能雖然尚不明確，但對(duì)于蛋白質(zhì)亦不可或缺。34位的Leu位于蛋白六聚體的表面，Leu是疏水性氨基酸，位于蛋白結(jié)構(gòu)表面，不利于蛋白質(zhì)表面形成水化膜以保護(hù)蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，而Gln側(cè)鏈?zhǔn)怯H水基團(tuán)，有利于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，且側(cè)鏈酰胺基團(tuán)的存在可以與附近的氨基酸殘基形成氫鍵，一定程度上限制了周?chē)鸁o(wú)規(guī)則卷曲的柔性結(jié)構(gòu)，因而34位的Leu突變成Gln致使突變酶的溫度穩(wěn)定性略有提高。圓二色譜結(jié)果表明，突變酶E2-4的α-螺旋增加，表明其溫度穩(wěn)定性有所改善，而E3-11的α-螺旋數(shù)減少，無(wú)規(guī)則卷曲增加，表明其柔性增加，有利于酶與輔酶、底物的結(jié)合與釋放，蛋白結(jié)構(gòu)柔性含量增加可能是3 個(gè)突變體酶活性提高的原因，但同時(shí)無(wú)規(guī)則卷曲的增加也使突變酶剛性結(jié)構(gòu)減少，不利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這與熱穩(wěn)定性研究結(jié)果一致。

通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)提高巨大芽孢桿菌谷氨酸脫羧酶的酶催化活性，提高該酶應(yīng)用于工業(yè)的潛在價(jià)值，也為GAD分子改造方面提供更多參考，利于后續(xù)有關(guān)GAD的研究。也說(shuō)明通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)可以顯著提高巨大芽孢桿菌谷氨酸脫羧酶的催化活性。