楊玉玲，周磊，游遠(yuǎn)，湯曉智，魏蘇萌

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氧化對(duì)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠質(zhì)構(gòu)特性及保水性的影響

楊玉玲，周磊，游遠(yuǎn)，湯曉智，魏蘇萌

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）

【目的】研究氧化對(duì)肌原纖維蛋白（myofibrillar proteins，MP）凝膠質(zhì)構(gòu)和保水性的影響，探討凝膠特性隨蛋白質(zhì)氧化程度變化的根本原因，為MP凝膠特性控制和雞肉制品的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)?！痉椒ā炕铍u屠宰，取雞胸肉提取MP。利用質(zhì)構(gòu)儀研究在脂肪氧化酶-亞油酸體系中蛋白質(zhì)氧化對(duì)MP凝膠質(zhì)構(gòu)的影響；用高速離心機(jī)測(cè)定凝膠保水性；用拉曼光譜法測(cè)定I760和I850/I830表示MP凝膠的疏水作用力和氫鍵，Zeta電位法測(cè)定電位值代表靜電斥力；通過總巰基含量的變化反應(yīng)二硫鍵的變化；通過掃描電鏡觀察凝膠的超微結(jié)構(gòu)；通過氨基酸分析儀研究氧化對(duì)MP氨基酸含量的影響?！窘Y(jié)果】在脂肪氧化酶-亞油酸-MP體系中，隨著亞油酸濃度增加，MP中羰基含量逐步增加，氧化程度逐漸增高。亞油酸含量從0增加到2 mmol·L-1時(shí)，凝膠硬度和保水性均逐漸增加到最大值，而后隨亞油酸濃度增加均逐漸下降；凝膠彈性在低氧化程度下略有增加，但隨著氧化程度繼續(xù)增加而逐漸降低；亞油酸濃度為2 mmol·L-1時(shí)，MP凝膠結(jié)構(gòu)致密，多孔且孔徑均一。高度氧化的MP凝膠孔徑變大，空隙增多，膠束不均勻。隨著氧化程度升高，拉曼光譜的I760在2 mmol·L-1處達(dá)到最大值，表明疏水相互作用力在此處達(dá)到最大。Ser, Glu和Cys 3種氨基酸殘基能夠形成MP分子內(nèi)氫鍵，這3種氨基酸含量隨著氧化程度的升高而降低，同時(shí)拉曼光譜的I850/I830隨氧化程度的升高而增加，最終大于1.25，表明MP分子間的氫鍵隨著氧化程度的升高而減少。解離后帶負(fù)電荷的Glu含量隨氧化程度升高而降低，導(dǎo)致Zeta電位絕對(duì)值下降，表明靜電相互作用隨氧化程度增加而減弱。Cys的巰基在凝膠形成過程中能夠形成二硫鍵，其含量隨氧化程度的升高而降低，導(dǎo)致總巰基含量同向變化，表明氧化過程中二硫鍵生成。疏水性氨基酸（Ala，Met，Val，Leu，Ile和Phe）的總量隨氧化程度升高而變化，在亞油酸為2 mmol·L-1處達(dá)到最大值，這為疏水作用力在2 mmol·L-1處達(dá)到最大值提供了證據(jù)。主成分分析表明疏水相互作用對(duì)脂質(zhì)酶氧化體系下MP凝膠特性起決定性作用。【結(jié)論】適度氧化有助于改善MP凝膠的特性，在脂肪氧化酶-亞油酸體系中，亞油酸濃度為2 mmol·L-1時(shí)，MP凝膠的硬度和保水性都獲得最大值。其原因?yàn)檠趸饔酶淖僊P的組成和疏水作用力，在亞油酸2 mmol·L-1時(shí)，MP分子中疏水性氨基酸總量最高，疏水作用力最大，形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)均勻致密，因此MP凝膠的質(zhì)構(gòu)和保水性均獲得最大值。

肌原纖維蛋白；凝膠特性；氧化；氨基酸；蛋白質(zhì)分子作用力

0 引言

【研究意義】在肉品貯藏和加工中常常發(fā)生脂肪氧化，脂肪氧化產(chǎn)生的自由基能導(dǎo)致肌原纖維蛋白（MP）同時(shí)氧化，引起蛋白質(zhì)凝膠特性發(fā)生改變，進(jìn)而引起肉制品感官品質(zhì)如硬度、彈性、黏性等發(fā)生改變[1-2]。研究氧化對(duì)MP凝膠特性的影響，揭示氧化對(duì)MP凝膠特性影響的根本原因，能為MP凝膠特性控制和雞肉制品的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有報(bào)道認(rèn)為氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠強(qiáng)度和保水性顯著下降。DECKER等[3]研究了離子催化氧化體系對(duì)火雞肉白肌MP的凝膠質(zhì)構(gòu)和保水性的影響，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化過程中凝膠強(qiáng)度和保水性都顯著下降。BERTRAM等[4]對(duì)氧化處理的豬肉MP研究發(fā)現(xiàn)，隨著氧化程度的增加（H2O2濃度的增加），蛋白質(zhì)的保水性降低。但也有報(bào)道認(rèn)為溫和氧化有利于提高其凝膠特性并導(dǎo)致保水性增加。SNIDER等[5]發(fā)現(xiàn)溫和氧化有利于蛋清蛋白的聚集，提高其凝膠特性。SRINIVASAN等[6]冷凍儲(chǔ)藏牛肉糜后發(fā)現(xiàn)冷凍促進(jìn)了其蛋白和脂肪氧化，凝膠彈性也增大。XIONG等[7]也發(fā)現(xiàn)適度氧化的樣品擁有更好的彈性和更均勻細(xì)膩的凝膠微觀結(jié)構(gòu)。KELLEHER等[8]研究發(fā)現(xiàn)在水溶性和脂溶性抗氧化劑混合的肉糜體系中，保水性隨著氧化程度的升高而增加。MP凝膠作用力決定其凝膠特性，疏水作用力、靜電作用力和氫鍵是影響此凝膠性質(zhì)的主要作用力，二硫鍵的作用較小[9]。ZHANG等[10]和WANG等[11]用拉曼光譜法研究了MP凝膠的疏水作用力和氫鍵?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然氧化對(duì)MP凝膠特性的影響已有一些報(bào)道，但結(jié)果卻是矛盾的。其原因是采用的氧化體系不同，與FeCl3+H2O2氧化體系相比，采用亞油酸-脂肪氧化酶體系進(jìn)行研究更接近氧化發(fā)生的實(shí)際情況。脂肪氧合酶是脂肪氧化的一種重要方式，氧化過程中會(huì)產(chǎn)生自由基和含羰基的化合物，后者進(jìn)而氧化MP，但利用亞油酸-脂肪氧化酶體系研究氧化對(duì)MP凝膠特性影響原因卻未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】借助脂肪氧化酶-亞油酸氧化體系產(chǎn)生自由基使MP發(fā)生不同程度的氧化，研究蛋白質(zhì)氧化對(duì)MP凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和保水性的影響。通過研究氧化對(duì)MP凝膠特性、作用力（疏水相互作用、氫鍵、靜電相互作用和二硫鍵）和分子組成的影響，從分子水平上揭示MP氧化對(duì)其凝膠特性影響的根本原因。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年6—11月在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)進(jìn)行。

1.1 主要材料與試劑

40日齡的活A(yù)A雞（母雞和公雞各半），購于南京江寧西北村養(yǎng)雞場(chǎng)，就地屠宰后取雞胸肉，運(yùn)輸途中加冰保管，儲(chǔ)存于-18℃下并在1個(gè)月內(nèi)使用。

脂肪氧化酶LOX 1000 000單位/mL和亞油酸色譜純，含量≥99.0%均購于Sigma公司。

其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Beckman Avanti J-26 XP落地式高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司；DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；TA. XT. Plus. 質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；TM 3000 掃描電子顯微鏡，日本日立公司；LABRAM 800型激光拉曼譜儀，法國Jobin Yvon公司；Zetasizer Nano ZS Zeta電位分析儀，英國馬爾文公司；U-3900紫外分光光度計(jì)，日本日立公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MP的提取 冷凍雞胸肉在4℃下解凍20 min，剔除脂肪和結(jié)締組織，切碎后參照XIONG等[12]的方法提取MP，提取的蛋白質(zhì)在4℃下保存，3 d內(nèi)用完。

1.3.2 MP的氧化處理及凝膠的制備 取適量MP，用磷酸鹽緩沖液（0.6 mol·L-1KCl、0.01 mol·L-1KH2PO4，pH 6.0）配制60、25、1 mg·mL-1的MP溶液，向其中分別加入0、0.2、1、2、4、10 mmol·L-1亞油酸溶液，分別加入5 000單位/mL脂肪氧化酶，在4℃下氧化24 h，用1 mmol·L-1EDTA終止氧化，得到經(jīng)過氧化處理的MP溶液[13]。

氧化處理后的MP樣品水浴加熱至70℃（1℃·min-1）制成凝膠，保溫20 min，取出后自然冷卻，4℃保存16 h后備用。25 mg·mL-1的MP凝膠用于質(zhì)構(gòu)特性、保水性和微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定。1 mg·mL-1的MP凝膠用于靜電相互作用和巰基含量的測(cè)定。60 mg·mL-1的MP凝膠用于拉曼光譜測(cè)定氫鍵和疏水相互作用。

1.3.3 MP羰基含量的測(cè)定 羰基含量的測(cè)定參照LEVINE等[14]的方法并略作修改，在離心管中加入0.5 mL蛋白溶液（25 mg·mL-1）和2 mL 2, 4-二硝基苯肼溶液（10 mmol·L-1），在室溫下反應(yīng)40 min，對(duì)照組只加入2 mL不含2, 4-二硝基苯肼的2 mol·L-1HCl，不再添加之后步驟的試劑。向離心管中加入2.5 mL 20%的TCA（三氯乙酸），振蕩后離心（11 000×，5 min），棄上清，用2 mL乙醇-乙酸乙酯溶液（體積比1﹕1）清洗蛋白沉淀3次，除去未反應(yīng)的試劑。加6 mol·L-1鹽酸胍6 mL溶解蛋白沉淀。在37℃下放置30 min，空白組作為對(duì)照，測(cè)定370 nm處吸光值，使用摩爾吸光系數(shù)2.2×104mol·L-1·cm-1計(jì)算羰基衍生物含量（μmol·g-1protein）。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定 用質(zhì)構(gòu)儀按照楊玉玲等[15]的方法和條件測(cè)定MP熱誘導(dǎo)凝膠的硬度和彈性。參數(shù)如下：P/6探頭，測(cè)試前速度5 mm·s-1，測(cè)試中速度1 mm·s-1，測(cè)試后速度5 mm·s-1，探頭探入距離為10 mm。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.5 保水性的測(cè)定 用高速冷凍離心機(jī)參照KOCHER等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。將氧化后的MP凝膠和離心管稱重（W1），于4℃下離心（10 000×，15 min），除上清液后稱量離心管和凝膠的重量（W2），空離心管的質(zhì)量為W。根據(jù)下列公式計(jì)算凝膠保水性WHC(%)=(W2-W)/(W1-W)×100。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)的觀察 將凝膠切塊，用戊二醛固定3 h，清洗，利用乙醇（50%，70%，90%，95%和100%）梯度脫水，每個(gè)濃度處理30 min。再用叔丁醇置換，冷凍干燥，鍍膜后用掃描電鏡（SEM）觀察微觀結(jié)構(gòu)，掃描電鏡加速電壓15 kV。

1.3.7 激光拉曼光譜法測(cè)試 按照ZHANG等[17]的方法和條件用拉曼光譜儀測(cè)定MP凝膠的疏水相互作用和氫鍵作用。激光波長：514.5 nm；激光出射功率：10 mw（照到樣品上約4 mW）；顯微物鏡：50倍長焦距；光柵：600；狹縫（Hole）：200 μm；積分時(shí)間：60 s；重復(fù)3次累加得譜。用I760 cm-1處強(qiáng)度反映MP凝膠的疏水相互作用[18]。I850/I830值反映MP凝膠的氫鍵變化[19]。

1.3.8 Zeta電位法測(cè)試 MP凝膠的靜電斥力用樣品的Zeta電位表示。將1 mg·mL-1的MP凝膠樣品注入Zeta電位皿后，蓋上塞子，勿留氣泡，進(jìn)行Zeta電位測(cè)試。測(cè)試參數(shù)：散射角90°，平衡時(shí)間60 s，測(cè)試溫度25℃。每個(gè)梯度重復(fù)3次。

1.3.9 MP巰基含量的測(cè)定 采用ELLMAN法[20]測(cè)定MP凝膠的總巰基和活性巰基含量。將0.5 mL MP樣品（1 mg·mL-1）依次與4.5 mL緩沖液（由0.01 mol·L-1EDTA，8 mol·L-1尿素和0.1 mol·L-1K2HPO4配制而成，pH 6.0）、100 μL Ellman試劑（由10 mmol·L-1DTNB和0.01 mol·L-1KH2PO4緩沖液配制而成，調(diào)pH為6.0）混合，使用旋渦振蕩約1 min，使溶液混合充分，在室溫、避光條件下靜置25 min，用紫外分光光度計(jì)于412 nm下測(cè)定吸光值，摩爾消光系數(shù)設(shè)為1.36×10-4mol·L-1·cm-1，巰基含量用nmol·mg-1protein表示。每個(gè)樣品測(cè)定3次。

用不含尿素的緩沖液以同樣的方法測(cè)定樣品中活性巰基的含量。

1.3.10 MP氨基酸含量測(cè)定 氨基酸含量測(cè)定的方法參照PARK等[21]并做部分修改。稱取一定量的MP凝膠于10 mL玻璃水解管中，加入6 mol·L-1的鹽酸，在氮?dú)猸h(huán)境下完全水解并濃縮，用0.02 mol·L-1的鹽酸溶解后，以15 000 r/min離心5 min，得上清液備用。取適量上清液通過0.22 μm濾器過濾，采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸組分分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析和主成分分析。

2 結(jié)果

2.1 氧化對(duì)MP羰基含量的影響

圖1反映了氧化條件下MP羰基含量的變化。在脂肪氧化酶-亞油酸-MP體系中，隨著亞油酸濃度的增加，羰基含量不斷增加，并最終達(dá)到2.96 μmol·g-1protein，這表明MP氧化程度隨亞油酸含量增加而逐漸升高。

蛋白質(zhì)在氧化過程中，羰基基團(tuán)的引入是蛋白質(zhì)氧化過程中的明顯變化，其含量可作為蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)[22]。蛋白質(zhì)分子自身結(jié)構(gòu)中不含有天然存在的羰基，但是蛋白質(zhì)氧化能夠?qū)Ⅳ驶鶊F(tuán)引入到蛋白質(zhì)分子，在脂肪氧化酶-亞油酸氧化體系下，蛋白質(zhì)分子與脂質(zhì)氧化二級(jí)產(chǎn)物以及自由基結(jié)合，肽骨架的斷裂，氨基酸側(cè)鏈的直接氧化，這些都會(huì)導(dǎo)致羰基的產(chǎn)生。隨著亞油酸濃度的增加，羰基含量逐漸升高，說明蛋白質(zhì)氧化程度越來越高。

圖1 氧化對(duì)MP羰基含量的影響

2.2 氧化對(duì)MP凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

圖2反映了不同氧化程度下MP凝膠硬度和彈性的變化。凝膠硬度隨亞油酸濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在2 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值。亞油酸含量從0增加到2 mmol·L-1時(shí)，MP凝膠硬度從10.50 g增加到最大值12.95 g，與對(duì)照組相比，凝膠硬度增加了21.9%；隨著亞油酸濃度繼續(xù)增加，凝膠硬度迅速下降，在亞油酸10 mmol·L-1處下降到8.23 g，比對(duì)照組降低了21.6%。凝膠彈性在亞油酸含量為0.2 mmol·L-1時(shí)比對(duì)照組略有增加，之后隨著氧化程度繼續(xù)增加，彈性逐漸降低，在10 mmol·L-1處達(dá)到最低值，比對(duì)照組的凝膠彈性降低了64.3%。表明在脂質(zhì)酶氧化體系下，低程度氧化改善了MP凝膠的硬度；高濃度氧化會(huì)降低MP凝膠的硬度和彈性，削弱MP凝膠的形成能力。

2.3 氧化對(duì)MP凝膠保水性的影響

如圖3所示，在0—0.2 mmol·L-1亞油酸濃度的低氧化程度下，MP凝膠的保水性變化不大；隨著亞油酸濃度增加（0.2—10 mmol·L-1），氧化程度升高，保水性呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)亞油酸濃度為2 mmol·L-1時(shí)，保水性到達(dá)最大值，然后再降低。表明適度氧化能改善凝膠的持水性。

圖2 氧化對(duì)MP凝膠硬度和彈性的影響

圖3 氧化對(duì)MP凝膠保水性的影響

2.4 氧化對(duì)MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

不同氧化程度的MP凝膠結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別（圖4）。未經(jīng)過氧化處理的MP凝膠孔隙比較均勻、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也比較致密；隨著氧化程度的增加（0.2—2 mmol·L-1），凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越來越致密，亞油酸濃度為2 mmol·L-1時(shí)形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)最為均勻細(xì)膩，孔徑均一，呈現(xiàn)“蜂窩狀”膠束。而隨著氧化程度繼續(xù)增大（2— 10 mmol·L-1），網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變少，凝膠孔徑增大，膠束不均勻，形成大小不一的蛋白質(zhì)膠束。亞油酸濃度為10 mmol·L-1時(shí)形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)均勻性最差，孔徑變大，空隙增多。因此在亞油酸濃度為2 mmol·L-1處MP凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最佳。

2.5 拉曼光譜測(cè)試結(jié)果

2.5.1 氧化對(duì)MP凝膠疏水作用力的影響 拉曼光譜760 cm-1處色氨酸環(huán)伸縮振動(dòng)反映了MP凝膠的疏水相互作用[18]。如圖5所示，隨著氧化程度的升高，MP凝膠760 cm-1處歸一化強(qiáng)度（I760）隨著亞油酸濃度的增加先升高后降低，在2 mmol·L-1處達(dá)到最大值，表明疏水相互作用先增加（0—2 mmol·L-1），然后隨著氧化程度進(jìn)一步增強(qiáng)而降低，這說明隨著氧化程度的增加，疏水作用力先增加后降低，在2 mmol·L-1處獲得最大值。由此可知，低程度氧化可增大MP凝膠的疏水作用力，但高程度氧化減弱了MP凝膠的疏水作用力。

2.5.2 氧化對(duì)MP凝膠氫鍵的影響 在圖6中，未經(jīng)氧化處理的對(duì)照樣I850/I830比值為0.98；隨著亞油酸含量增加，I850/I830比值快速增加；當(dāng)亞油酸含量大于2 mmol·L-1時(shí)，I850/I830比值大于1.25。這表明，在對(duì)照組中，酪氨酸上-OH既與水形成氫鍵又與蛋白質(zhì)上其他中性基團(tuán)形成氫鍵。但隨著氧化程度增加，蛋白質(zhì)分子間氫鍵逐漸解體，到達(dá)2 mmol·L-1時(shí)，酪氨酸上的-OH完全暴露在水環(huán)境中，與溶劑水分子生成氫鍵，也就是說MP分子間的氫鍵作用隨著氧化程度的升高而減少。

2.6 氧化對(duì)MP凝膠靜電相互作用的影響

Zeta電位與分散體系凝結(jié)的穩(wěn)定性密切相關(guān)，可用于體現(xiàn)膠體粒子之間的靜電相互作用[23-24]。通常蛋白質(zhì)分子表面帶凈負(fù)電荷，靜電相互作用表現(xiàn)為斥力，Zeta電位值為負(fù)值。當(dāng)溶液中存在的膠粒攜帶了大量正或負(fù)電荷，即Zeta電位的絕對(duì)值較大時(shí)，膠粒間斥力占優(yōu)勢(shì)，不會(huì)發(fā)生絮凝。但當(dāng)膠粒的Zeta電位絕對(duì)值較低時(shí)，粒子會(huì)相互接近并發(fā)生絮凝。

圖4 氧化對(duì)MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖5 歸一化的760 cm-1處條帶強(qiáng)度隨亞油酸濃度的變化

圖6 歸一化的I850/I830強(qiáng)度隨亞油酸濃度的變化

在圖7中，Zeta電位絕對(duì)值隨著亞油酸濃度的增加而降低，表明靜電相互作用隨著氧化程度的增加而減弱。氧化引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，影響蛋白表面電荷，即導(dǎo)致Zeta電位的變化。MP分子中的某些基團(tuán)會(huì)與水分子結(jié)合，如帶電基團(tuán)與水分子進(jìn)行離子-偶極相互作用，Asn、Gln上的酰胺基團(tuán)，Thr、Tys、Ser殘基的-OH以及肽鍵進(jìn)行偶極-偶極相互作用，非極性殘基也能與水分子進(jìn)行偶極-誘導(dǎo)-偶極相互作用。如帶正電荷的賴氨酸與自由基和醛類物質(zhì)反應(yīng)生成中型的羰基衍生物[25]。Zeta電位的下降可能是由于隨著氧化程度的增加，包埋的帶電荷的氨基酸殘基暴露出來，與氧化產(chǎn)物反應(yīng)，生成電中性的其他物質(zhì)，導(dǎo)致了Zeta電位的降低。

圖7 Zeta電位隨亞油酸濃度的變化

2.7 氧化對(duì)巰基含量的影響

蛋白質(zhì)中包含的巰基有兩種形式，一種是暴露于蛋白質(zhì)表面的，另一種是包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的?？値€基包括以上二者，而活性巰基只包括前者[26]?？烧J(rèn)為總巰基含量的減少代表二硫鍵的生成[27]。

如圖8所示，隨著亞油酸濃度的升高，總巰基含量和活性巰基含量均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。在亞油酸濃度為10 mmol·L-1時(shí)，總巰基和活性巰基含量最低，表明氧化過程中二硫鍵不斷生成。二硫鍵在MP凝膠形成以及維持凝膠功能特性和結(jié)構(gòu)方面起著重要作用[28-29]。加熱時(shí)MP分子展開，暴露出內(nèi)部的巰基與疏水基團(tuán)，巰基反應(yīng)生成二硫鍵，疏水基團(tuán)聚集，形成具有一定強(qiáng)度的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有助于穩(wěn)定其中的脂質(zhì)和水分，形成更好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增加凝膠強(qiáng)度。

2.8 氧化對(duì)MP分子氨基酸含量的影響

表1中，Cys的含量隨著氧化程度的升高而降低，Cys的巰基在凝膠形成過程中能夠形成二硫鍵；側(cè)鏈?zhǔn)杷宰顝?qiáng)的3種氨基酸Leu，Ile和Phe的含量隨氧化程度的變化不顯著；但疏水性氨基酸（Ala，Met，Val，Leu，Ile和Phe）總量變化顯著，并且最大值發(fā)生在亞油酸濃度為2 mmol·L-1處。Ser，Glu和Cys 3種氨基酸殘基能夠形成MP分子內(nèi)氫鍵，這3種氨基酸的含量隨著氧化程度的升高而降低。正電荷的氨基酸Lys，Arg和His隨氧化程度變化不顯著，但是解離后帶負(fù)電荷的Glu含量隨著氧化程度的升高而減少。

圖8 氧化對(duì)總巰基和活性巰基含量的影響

表1 不同氧化程度下MP的氨基酸含量

所有數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），同一行不同字母顯著相關(guān)性（＜0.05）

Data are expressed as the mean±SD (n=3), different superscripted letters in the same line indicate significantly different at＜0.05

2.9 主成分分析

用SPSS軟件對(duì)凝膠特性和作用力進(jìn)行主成分分析（表2）。從表2可見，第一個(gè)主成分能解釋總體方差變異的72.124%，兩個(gè)主成分的累積解釋方差已經(jīng)達(dá)到95.096%，且這兩個(gè)主成分的特征值均超過1，基本可以解釋原來所有指標(biāo)包含的信息，故選取這兩個(gè)主成分作為評(píng)價(jià)不同氧化程度下MP凝膠特性和化學(xué)作用力關(guān)系的綜合指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)（圖9）。

圖9 不同氧化程度下主成分評(píng)分

表2 不同氧化程度處理下MP凝膠的主成分分析

從圖9可見，第一主成分與硬度、彈性、保水性、總巰基和I760均呈現(xiàn)正相關(guān)性，與羰基含量、氫鍵和Zeta電位呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。第二主成分與羰基含量正相關(guān)性比較高，與總巰基呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。硬度、彈性、保水性與I760都處于第一象限并且比較接近，這表明疏水相互作用對(duì)脂質(zhì)酶氧化體系下MP凝膠形成起著重要甚至是決定性作用。

3 討論

3.1 不同氧化體系下的MP凝膠質(zhì)構(gòu)特性比較

在脂肪氧化酶-亞油酸-MP體系中，亞油酸是油脂氧化反應(yīng)產(chǎn)生自由基的底物，本試驗(yàn)中隨著亞油酸含量增加，MP中羰基含量不斷增加，這表明MP氧化程度隨亞油酸含量增加而逐漸升高。因此，可以用亞油酸含量高低代表氧化程度大小。DEAN等[22]也獲得了相同的結(jié)論。本試驗(yàn)中，亞油酸含量從0增加到2mmol·L-1時(shí)，MP凝膠硬度逐漸增加到最大值，隨著亞油酸濃度繼續(xù)增加，凝膠硬度迅速下降。原因可能是氧化改變了凝膠的疏水作用力或二硫鍵[30]。凝膠彈性在亞油酸含量為0.2mmol·L-1時(shí)比對(duì)照組略有增加，之后隨著氧化程度繼續(xù)增加，彈性逐漸降低。胡忠良[31]研究了羥自由基氧化體系（H2O2+FeCl3）對(duì)雞胸肉MP凝膠硬度和彈性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著氧化程度的升高，凝膠的硬度、彈性均先增加后降低，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。而李銀等[32]發(fā)現(xiàn)在羥自由基氧化體系下豬肉MP凝膠硬度隨著H2O2濃度增加逐漸降低，造成這種差別的原因可能是MP的來源不同，本試驗(yàn)中的MP來自雞胸肉，而李銀等[32]的MP則來自豬長肌；也可能是試驗(yàn)設(shè)計(jì)的問題，如果氧化體系反應(yīng)物濃度間隔太大，有可能漏掉其中的某些變化。

3.2 本氧化體系下的MP凝膠特性與微觀結(jié)構(gòu)

MP凝膠的保水性與凝膠硬度一樣，隨著氧化程度升高逐漸增加，當(dāng)亞油酸濃度為2mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，而后逐漸降低。在MP形成凝膠的過程中，亞油酸-脂肪氧化酶氧化體系會(huì)生成自由基中間物以及氫過氧化物如α, β-不飽和醛（丙烯醛和4-羥基-2-壬烯醛）和丙二醛（MDA）[33-34]，可能會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)分子之間以及蛋白質(zhì)分子-脂質(zhì)交聯(lián)的形成，從而提高了MP凝膠的保水性和硬度。XIONG等[35]的觀點(diǎn)是氧化使蛋白質(zhì)的溶解度和巰基含量減少，導(dǎo)致蛋白凝膠保水性的下降。但也有研究發(fā)現(xiàn)，氧化并不一定降低蛋白質(zhì)的加工特性，KELLEHER等[36]對(duì)鯖魚肉糜研究發(fā)現(xiàn)隨著氧化程度增加，肉糜保水性也持續(xù)增加。良好的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能更好地束縛水分，增強(qiáng)凝膠抗壓能力，使得凝膠的硬度和保水性增加。使用掃描電鏡對(duì)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在亞油酸濃度為2mmol·L-1時(shí)，MP形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)最為均勻細(xì)膩，孔徑均一，呈現(xiàn)“蜂窩狀”膠束；而亞油酸濃度為10mmol·L-1時(shí)，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)均勻性最差，孔徑變大。這可能是由于亞油酸濃度在0—2 mmol·L-1范圍內(nèi)，輕度氧化能促進(jìn)蛋白質(zhì)分子變性和展開，但變性速度隨亞油酸濃度增加僅緩慢增加，致使較多變性的MP分子能從容重排，形成致密細(xì)膩的凝膠結(jié)構(gòu)；而在高濃度氧化劑下，劇烈的氧化使過多的蛋白質(zhì)分子快速變性并聚集，來不及有序重排，因此形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)均勻性最差，孔徑變大。胡忠良等[31]利用羥基自由基體系研究氧化對(duì)MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響時(shí)，也發(fā)現(xiàn)過度氧化導(dǎo)致凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變差。

3.3 氧化反應(yīng)與作用力變化

測(cè)定蛋白質(zhì)疏水作用力的方法主要有兩種，一種是ANS探針法，另一種為拉曼光譜法，前一種方法必須在極稀的溶液中進(jìn)行測(cè)定，后者更適合于凝膠蛋白質(zhì)樣品的測(cè)定，因此本試驗(yàn)用拉曼光譜的I760強(qiáng)度表達(dá)MP凝膠的疏水作用力[37]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著氧化程度的增加，疏水作用力先增加后降低，在2mmol·L-1處獲得最大值。在MP凝膠的形成過程中，隨著氧化程度的升高（0—2 mmol·L-1），MP分子部分展開，使得疏水性基團(tuán)暴露，增強(qiáng)了疏水相互作用，此外脂質(zhì)酶氧化體系的二級(jí)產(chǎn)物、氫過氧化物和過氧自由基會(huì)與氨基酸基團(tuán)反應(yīng)，如賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸能與α, β-不飽和醛反應(yīng)，從而引入一條疏水性側(cè)鏈，這使得疏水相互作用在低氧化程度下增強(qiáng)。但是，當(dāng)亞油酸濃度繼續(xù)增加（2—10 mmol·L-1），疏水相互作用降低，可能是因?yàn)槭杷曰鶊F(tuán)被氧化為親水性基團(tuán)，比如蛋氨酸被氧化為蛋氨酸亞砜。LI等[38]用ANS探針法研究了經(jīng)FeSO4-抗壞血酸氧化體系處理的肌球蛋白的疏水性變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)表面疏水性隨著氧化程度的增加而增加；WU等[39]報(bào)道了大豆蛋白氧化會(huì)導(dǎo)致表面疏水性的降低。造成各種結(jié)果不一致的原因很多，包括測(cè)定方法，蛋白質(zhì)原料、氧化體系等試驗(yàn)設(shè)計(jì)和條件等。

拉曼光譜I850與I830共軛雙峰比值變化能反映出MP中氫鍵的變化趨勢(shì)圖[19]。當(dāng)I850/I830≥1.25時(shí)，代表酪氨酸上的-OH與溶劑水分子生成氫鍵；I850/I830≤0.5時(shí)，表明酪氨酸殘基包埋在疏水環(huán)境中，與蛋白質(zhì)分子上其他極性基團(tuán)生成氫鍵。本試驗(yàn)中未經(jīng)氧化處理的對(duì)照組比值為0.98，表明酪氨酸殘基形成的氫鍵既包括暴露的氫鍵，也包括埋藏的氫鍵；隨氧化程度增加，I850/I830比值增加，表明MP酪氨酸殘基苯環(huán)上的-OH與MP分子其他殘基（如-COOH）生成的氫鍵逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榕c水分子生成的氫鍵，即MP分子間的氫鍵作用隨著氧化程度的升高而減少。在蛋白質(zhì)經(jīng)過高度氧化后，MP分子展開，而且MP分子疏水性降低，這使絡(luò)氨酸殘基處于親水性微環(huán)境，埋藏的MP分子內(nèi)部的氫鍵轉(zhuǎn)變?yōu)镸P分子與水分子之間的氫鍵。XU等[40]研究加熱過程中（20℃—70℃）豬肉MP I850/I830的變化，發(fā)現(xiàn)共軛雙峰的比值從1.13升高到2.56，他們認(rèn)為加熱使酪氨酸殘基暴露在水溶液環(huán)境中。SUN等[41]對(duì)豬肉MP研究也證實(shí)埋藏的絡(luò)氨酸殘基會(huì)導(dǎo)致I850/I830共軛雙峰值的降低，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究中MP凝膠的靜電作用力隨著氧化程度的升高而減弱，這可能是由于帶電荷的氨基酸含量發(fā)生變化導(dǎo)致。一般情況下，總巰基的減少表示二硫鍵的生成[27]。MP分子中含有的大量巰基，在氧化體系中能被不同程度的氧化，并且產(chǎn)生相關(guān)共價(jià)化合物[42-43]。巰基（-SH）能被氧化成為二硫鍵（-S-S-）、次磺酸（RSOH）、亞磺酸（-SO2H）和磺酸（-SO3H）等形式[44]。其中巰基（-SH）被氧化成為可逆的氧化形式：二硫鍵（-S-S-）和次磺酸（RSOH），導(dǎo)致二硫鍵含量增加；但是也可能會(huì)被氧化成為不可逆的氧化形式：亞磺酸（-SO2H）和磺酸（-SO3H），這會(huì)導(dǎo)致MP分子中總巰基含量以及二硫鍵含量的降低。本研究中巰基含量隨氧化程度的升高而持續(xù)降低，說明氧化一定程度上導(dǎo)致二硫鍵增加。隨著亞油酸濃度的升高，氧化程度不斷增強(qiáng)，MP分子的半胱氨酸殘基的-SH被氧化成二硫鍵或其他含硫氧化物[45]，其總巰基和活性巰基含量降低是必然的。

3.4 氧化體系下MP組成、作用力與凝膠特性的內(nèi)在關(guān)系

本研究中疏水性氨基酸Ala、Leu、Ile和Phe的含量隨氧化程度的變化不顯著，Val和Met含量隨氧化程度升高而降低，但疏水性氨基酸的總量（Ala、Met、Val、Leu、Ile和Phe）隨氧化程度升高而顯著變化，在亞油酸為2mmol·L-1處達(dá)到最大值。在氧化過程中，疏水性氨基酸暴露于表面，并通過疏水相互作用相互聯(lián)接，因此導(dǎo)致測(cè)定的MP凝膠疏水相互作用也在亞油酸2mmol·L-1時(shí)達(dá)到了最大。通過對(duì)MP凝膠特性和作用力指標(biāo)進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，疏水相互作用對(duì)氧化體系下MP凝膠特性形成起決定性作用，這解釋了MP凝膠的硬度在2mmol·L-1處最大的原因，同時(shí)也說明了氧化通過改變MP分子中疏水氨基酸殘基含量和分布，改變凝膠的疏水相互作用，進(jìn)而控制凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。Ser，Glu和Cys 3種氨基酸殘基可形成分子內(nèi)氫鍵，蛋白質(zhì)氧化破壞了這3種氨基酸，使這3種氨基酸數(shù)量下降，從而導(dǎo)致了分子內(nèi)氫鍵降低。MP凝膠中的氫鍵可能與凝膠的彈性相關(guān)。PARK等[21]對(duì)經(jīng)過氧化的MP進(jìn)行氨基酸分析時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)，Cys和Met的含量隨著亞油酸濃度的升高而降低，與本研究一致。本試驗(yàn)中帶正電荷的氨基酸基團(tuán)（Lys，Arg,和His）和帶負(fù)電的氨基酸基團(tuán)（Asp）隨亞油酸濃度變化不顯著，但是帶負(fù)電荷的Glu被氧化修飾，與脂質(zhì)氧化二級(jí)產(chǎn)物以及自由基結(jié)合，生成羰基，這導(dǎo)致了蛋白質(zhì)分子電位降低，凝膠中靜電斥力降低。良好的凝膠是分子間引力和斥力相平衡的結(jié)果，斥力是防止凝膠絮凝的關(guān)鍵性作用力。這解釋了高氧化程度時(shí)凝膠微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)高孔徑變大，膠束不均勻的現(xiàn)象。因此氧化通過降低MP分子中Glu含量改變凝膠的靜電斥力，進(jìn)而改變凝膠的超微結(jié)構(gòu)和彈性。

4 結(jié)論

氧化作用改變了MP的組成，使其作用力發(fā)生變化，致使MP的超微結(jié)構(gòu)、質(zhì)構(gòu)特性和保水性發(fā)生變化。Ser、Glu和Cys 3種氨基酸殘基能夠形成分子內(nèi)氫鍵，隨著亞油酸濃度的增加，蛋白質(zhì)氧化程度越來越高，蛋白質(zhì)氧化破壞了3種氨基酸，使這3種氨基酸數(shù)量下降，從而減弱了分子內(nèi)氫鍵作用；Cys的巰基在凝膠形成過程中能夠形成二硫鍵，Cys的含量隨著氧化程度的升高而降低，導(dǎo)致二硫鍵增加。氧化降低了MP分子中解離后帶負(fù)電荷的Glu含量，從而減弱凝膠的靜電相互作用，進(jìn)而影響凝膠的超微結(jié)構(gòu)和凝膠的彈性。疏水性氨基酸的總量隨氧化程度升高而增加，在亞油酸為2 mmol·L-1處達(dá)到最大值，導(dǎo)致MP凝膠的疏水相互作用在亞油酸2 mmol·L-1時(shí)達(dá)到了最大，疏水相互作用對(duì)脂質(zhì)酶氧化體系下MP凝膠形成起著決定性作用，所以MP凝膠的硬度和保水性在2 mmol·L-1處最大，凝膠的超微結(jié)構(gòu)最佳。

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（責(zé)任編輯 楊鑫浩）

The Effects of Oxidation on Textural Properties and Water Holding Capacity of Heat-Induced Myofibrillar Protein Gel

YANG YuLing, ZHOU Lei, YOU Yuan, TANG XiaoZhi, WEI SuMeng

(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing 210023)

【Objective】This study was designed to investigate the influence of protein oxidation on the textural properties and water holding capacity of myofibrillar protein (MP) gel, and to reveal the root cause of gel properties changes with the degree of protein oxidation, in order to provide the theoretical basis for controlling the gel properties and the quality of chicken products.【Method】Live chickens were slaughtered and the chicken breast muscle was used to extract MP. Effects of protein oxidation on the textural properties of MP gel were studied in the lipoxygenase-linoleic acid-MP system using a texture analyzer. Water holding capacity (WHC) of MP gel was measured by high-speed centrifuge. I760 and I850/I830 measured by Raman spectroscopy were used to represent the hydrophobic interaction and hydrogen bonds of MP gel, and the potential value was determined by Zeta potential to reflect electrostatic repulsion.The change of disulfide bond was determined by the change of total sulfhydryl group (SH). The ultrastructures of the gel were observed by scanning electron microscopy. The amino acid composition and content were investigated by an amino acid analyzer. 【Result】The carbonyl content and the degree of oxidation of MP increased with increasing linoleic acid concentration in the lipoxygenase-linoleic acid-MP system. When the content of linoleic acid increased from 0 to 2 mmol·L-1, the gel hardness and WHC increased to the maximum, and then gradually decreased as the concentration of linoleic acid increased. Springiness slightly increased at low oxidation degree, and then decreased with more linoleic acid added. When the concentration of linoleic acid was 2 mmol·L-1, the network of the MP gel was dense, porous and uniform in pore size. The gel pore size became larger and uneven at higher linoleic acid concentration. I760 reached the maximum at 2 mmol·L-1with the increase of the degree of oxidation, which indicated that hydrophobic interaction force reached maximum. The intramolecular hydrogen bonds could be formed by the three amino acid residues Ser, Glu and Cys, and the content of these three amino acids decreased with the increase of the degree of oxidation. Meanwhile, the I850/I830 of the Raman spectrum increased with the increase of the degree of oxidation and finally ＞1.25, indicating that the hydrogen bonds between MP molecules decreased with the increase of the degree of oxidation. After dissociation, the content of negatively charged Glu decreased with the increase of the degree of oxidation, which led to the decrease of the absolute value of Zeta potential with the increase of the degree of oxidation, indicating that the electrostatic interaction decreased with the increase of the degree of oxidation. The sulfhydryl group of Cys could form disulfide bond in the gel formation process and the content of Cys decreased with the increase of the degree of oxidation, resulting in the change of the total sulfhydryl content in the same direction, which indicated the formation of disulfide bonds in the oxidation process. The total amount of hydrophobic amino acids (Ala, Met, Val, Leu, Ile and Phe) changed with increasing degree of oxidation and reached maximum at 2 mmol·L-1linoleic acid, which provided evidence that hydrophobic forces reached their maximum at 2 mmol·L-1. The principal component analysis suggested that hydrophobic interaction was the key force controlling the gel properties in the lipoxygenase- linoleic acid-MP system. 【Conclusion】Moderate oxidation of MP helped to improve the properties of MP gels, and the gel hardness of MP reached the maximum at 2 mmol·L-1in the lipoxygenase-linoleic acid-MP system. The reason was that oxidation changed the composition and hydrophobic forces of MP. When the linoleic acid was 2 mmol·L-1, the total amount of hydrophobic amino acid in MP molecule was the highest and the hydrophobic force was the largest, and the microstructure of the gel was uniform and dense, so that the texture and WHC of MP gel were the highest.

myofibrillar protein; gel properties; oxidation; amino acid; protein molecule forces

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.013

2018-03-14；

2018-05-15

國家自然科學(xué)基金（31371798）、江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

楊玉玲，E-mail：yulingy@sina.com