唐志康 陳文秋 余敏靈

摘要：以疊鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）為研究對象，樣品采用乙腈提取，經(jīng)Cleanert TPH專用凈化柱凈化。用GC-MS/MS測定樣品，根據(jù)色譜相對保留時(shí)間和質(zhì)荷比信息對樣品進(jìn)行定性分析，以樂果二級離子掃描峰（125.0/79.0）面積為參照峰，建立以樂果為對照品，測定疊鞘石斛中樂果等三種農(nóng)藥殘留量的GC-MS/MS方法。結(jié)果表明，樂果、敵敵畏、毒死蜱進(jìn)樣量在0.1～1.0 ng與它們的色譜峰面積有較好的線性關(guān)系，最低檢出限（以進(jìn)樣量計(jì)）分別為1.399×10-2、2.279×10-4、1.757×10-4 ng；平均回收率分別為95.4%、95.0%、94.7%。該一測多評方法簡單快速，定量準(zhǔn)確，適用于疊鞘石斛中樂果、敵敵畏、毒死蜱農(nóng)藥殘留的同時(shí)測定。

關(guān)鍵詞：GC-MS/MS；疊鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）；樂果；敵敵畏；毒死蜱

中圖分類號：O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）17-0088-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.023 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： To establish a quantitative method for the simultaneous measurement of the residual level of three pesticides in Dendrobium aurantiacum by GC-MS/MS. The samples were extracted by acetonitrile and purify by Cleanert TPH column. The samples were then tested by GC-MS/MS. Information on relative retention time and mass charge ratio was used for qualitative analysis. The peak area obtained by secondary ion MS of dimethoate（125.0/79.0） was used as the reference peak to establish a method using dimethoate as the reference substance to determinate there sidual quantity of three pesticides in Dendrobium aurantiacum by GC-MS/MS. When the injection quantity of the sample containing dimethoatea， dichlorvos and chlorpyrifosis in the range of 0.1～1.0 ng， there is a good linear relationship between the injection quantity and peak area. Limit of quantification（LOQ） of dimethoate， dichlorvos and chlorpyrifos are 1.399×10-2、2.279×10-4、1.757×10-4 ng； The average recovery rates of dimethoate， dichlorvos and chlorpyrifos are 95.4%， 95.0% and 94.7%. the method is simple， accurate， rapid and is appropriate for the quantification of residual quantity of dimethoate，dichlorvos and chlorpyrifos in Dendrobium aurantiacum.

Key words： GC-MS/MS； Dendrobium aurantiacum； dimethoate； dichlorvos； chlorpyrifos

中藥材種植及中藥飲片加工儲存過程中農(nóng)藥的不當(dāng)使用，均會影響中藥材中藥飲片質(zhì)量，嚴(yán)重危害人體健康[1]?！吨袊幍洹?015年版四部收載了多種農(nóng)藥殘留的氣相色譜檢查方法[2]。近年來，對農(nóng)藥殘留量研究報(bào)道的文獻(xiàn)大多以氣相色譜、液相色譜或以其與質(zhì)譜的聯(lián)用為主[3-8]。應(yīng)用GC-MS/MS，根據(jù)色譜保留時(shí)間和質(zhì)荷比信息對樣品進(jìn)行定性分析，以樂果二級離子掃描色譜峰（125.0/79.0）面積為參照，建立GC-MS/MS測定疊鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）中樂果等3種農(nóng)藥殘留一測多評方法[9]，取得了滿意的結(jié)果，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下，以期為GC-MS/MS測定中藥材農(nóng)藥殘留量提供一測多評[10-13]研究思路。

1 材料與儀器

1.1 材料

樂果、敵敵畏、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液（規(guī)格：100 μg/mL，樂果、敵敵畏、毒死蜱批號分別為GSB05-2286-2016、GSB05-2298-2016、GSB05-1849-2016，農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測保護(hù)研究所）。乙腈、丙酮為色譜純，氯化鈉、無水硫酸鈉為優(yōu)級純。疊鞘石斛樣品分別采于四川省夾江縣歇馬鄉(xiāng)、麻柳鄉(xiāng)、華頭鎮(zhèn)，按四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2010年版）鑒定[9]，并按該標(biāo)準(zhǔn)炮制規(guī)范制成3個(gè)批號樣品（歇馬鄉(xiāng)樣品為20161209-1，麻柳鄉(xiāng)樣品為20161209-2，華頭鎮(zhèn)樣品為20161209-3）。

1.2 儀器

GCMS-TQ8030氣質(zhì)聯(lián)用儀（島津中國科技有限公司）；Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細(xì)管柱，工作站為LabSolutions GCMS Solutions版本4.20（島津中國科技有限公司）；Cleanert TPH凈化柱（天津博納艾潔爾公司）。

1.3 方法

以樂果為對照品測定樣品中樂果、敵敵畏、毒死蜱的原理是利用樣品色譜圖中樂果色譜峰和敵敵畏色譜峰、毒死蜱色譜峰相對保留時(shí)間進(jìn)行定位[2]；二級離子碎片圖譜中樂果在47.0、62.0、79.0有碎片離子峰（豐度比為155∶13∶100，以79為參比），敵敵畏二級離子碎片圖譜中在63.0、93.0、109.0有碎片離子峰（豐度比為24∶100∶25，以93為參比），毒死蜱二級離子碎片圖譜中在19.9、257.9、285.9有碎片離子峰（豐度比為24∶100∶49，以258為參比）；通過定位和二級離子碎片圖譜碎片離子峰以及其豐度比對樂果、敵敵畏、毒死蜱色譜峰進(jìn)行定性分析。在定量分析時(shí)，精密量取樂果、敵敵畏、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液各適量，配制成不同濃度的混合溶液，按設(shè)定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，繪制樂果、敵敵畏、毒死蜱進(jìn)樣量對其峰面積的回歸曲線，以樂果回歸曲線斜率與敵敵畏、毒死蜱回歸曲線斜率的比計(jì)算校正因子（fs/k=Ks/Kk），通過樂果回歸曲線計(jì)算樂果含量，通過校正因子及樂果回歸曲線計(jì)算敵敵畏、毒死蜱含量。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備 精密量取樂果、敵敵畏、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL于10 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（每1 mL含樂果、敵敵畏、毒死蜱各10 μg）。

1.3.2 樣品溶液和空白溶液的制備 取疊鞘石斛（20161209-1）約50 g，粉碎，過3號篩，精密稱取細(xì)粉1.062 1 g于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，15 000 r/min勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，4 200 r/min離心5 min，取上清液于150 mL雞心瓶中，再于離心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重復(fù)勻漿提取一次，合并提取液，于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm高無水硫酸鈉，用10 mL正己烷-丙酮（6∶4）預(yù)洗后，將樣品濃縮液移入柱中，用25 mL正己烷-丙酮（6∶4）洗脫，收集洗脫液于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm濾膜過濾即得；除稱取樣品粉末外，按上述操作制備空白溶液。

1.3.3 樣品加標(biāo)溶液的制備 精密稱取“1.3.2”疊鞘石斛粉末1.021 3 g，按“1.3.2”樣品溶液的制備方法，從“置50 mL離心管中起到收集洗脫液于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干”，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，加標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液5 μL，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，0.2 μm濾膜過濾即得。

1.3.4 氣相條件 采用Rxi-5SilMS，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度250 ℃；線速度47.2 cm/s；程序升溫：50 ℃保持1 min，以25 ℃/min速率升至125 ℃，再以10 ℃/min速率升至300 ℃，保持15 min。進(jìn)樣體積1 μL。載氣：高純氦氣（>99.999%）。

1.3.5 質(zhì)譜條件 離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲時(shí)間5 min；碰撞氣為氬氣（純度大于99.999%）；電離方式見表1。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液50、100、200、250、300、400、500 μL分置于7個(gè)5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。以樂果、敵敵畏、毒死蜱二級離子掃描峰面積分別與對應(yīng)的樂果、敵敵畏、毒死蜱進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸。

1.4.2 精密度試驗(yàn) 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.2～5.0 mL于量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣6次測定精密度。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液200 μL，分別置6個(gè)5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。分別進(jìn)樣測定重復(fù)性。

1.4.4 樣品溶液穩(wěn)定性考察 取樣品加標(biāo)溶液分別在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h進(jìn)樣，測定樣品穩(wěn)定性。

1.4.5 最低檢出限 取樣品加標(biāo)溶液，按測定條件測得樂果、敵敵畏、毒死蜱的信噪比（S/N）分別為10.72、658.14、853.77，以S/N的3倍計(jì)算最低檢出限、10倍計(jì)算最低定量限。

1.4.6 回收率試驗(yàn) 取“1.3.2”方法的粉末9份，每份約1 g，精密稱定，分置9個(gè)50 mL離心管中，分為3組，每組3份，第1組中每份加標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液40 μL，第2組中每份加標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液50 μL，第3組中每份加標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液60 μL。取樣品溶液按測定條件分別進(jìn)樣，記錄圖譜；另取樂果對照品溶液用丙酮稀釋至含樂果0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 μg/mL的溶液，按測定條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算樂果二級離子掃描峰面積和進(jìn)樣量間的回歸方程得：A=615 047m-100.3（n=5，r=0.999 6），按回歸方程A=615 047m-102.4計(jì)算供試品中樂果含量；按校正方程A敵敵畏=615 047mf敵敵畏/樂果-102.4計(jì)算敵敵畏含量，按校正方程A毒死蜱=615 047mf毒死蜱/樂果-102.4計(jì)算毒死蜱含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 圖譜解析

精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液250 μL于5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。在“1.3.4”“1.3.5”條件下測定，取對照品溶液、樣品溶液、樣品加標(biāo)溶液、空白溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，在對照品溶液二級離子掃描色譜譜圖中有樂果二級離子掃描（125/79）、敵敵畏二級離子掃描（185/93）和毒死蜱二級離子掃（313.9/257.9）色譜峰，保留時(shí)間分別為10.663、5.690、13.191 min，在空白溶液色譜圖和樣品溶液色譜圖中沒有上述色譜峰，在樣品加標(biāo)溶液色譜圖中有和對照品溶液色譜圖中保留時(shí)間一致的樂果、敵敵畏、和毒死蜱二級離子掃描色譜峰，如圖1；對照品溶液和樣品加標(biāo)溶液的二級離子碎片圖譜中樂果在47、62、79處（豐度比為155∶13∶100，以79為參比），敵敵畏在63、93、109處（豐度比為24∶100∶25，以93為參比），毒死蜱在194、258、286處（豐度比為24∶100∶49，以258為參比），均有二級離子碎片峰，如圖2。

2.2 線性關(guān)系考察

以樂果二級離子掃描（125.0/79.0）峰面積A1與樂果進(jìn)樣量m1（ng）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A1=615 311m1-173，r1=0.999 8（n=7），樂果進(jìn)樣量在0.1～1.0 ng與樂果二級離子掃描峰（125.0/79.0）面積有較好的線性關(guān)系；以敵敵畏二級離子掃描峰（185.0/93.0）面積A2與敵敵畏進(jìn)樣量m2（ng）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A2=2 016 535m2-203，r2=0.999 7（n=7），敵敵畏進(jìn)樣量在0.1～1.0 ng與敵敵畏二級離子掃描峰（18.05/93.0）面積A2有較好的線性關(guān)系；以毒死蜱二級離子掃描峰（313.9/257.9）面積A3與毒死蜱進(jìn)樣量m3進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A3=1 278 304

m3-68，r3=0.999 3（n=7），毒死蜱進(jìn)樣量在0.1～1.0 ng與毒死蜱二級離子掃描峰（313.9/257.9）面積有較好的線性關(guān)系。

2.3 f值和t值的計(jì)算與耐受性考察

2.3.1 f值和t值的計(jì)算 敵敵畏色譜峰峰面積和樂果色譜峰峰面積的校正因子f敵敵畏/樂果=3.277 3，相對保留時(shí)間t敵敵畏/樂果=0.533 6；毒死蜱色譜峰峰面積和樂果色譜峰峰面積的校正因子f毒死蜱/樂果=2.077 5，相對保留時(shí)間t毒死蜱/樂果=1.237 1。

2.3.2 f值的耐受性考察 實(shí)際應(yīng)用中，色譜條件可能會有一些變化，因此對線速度、進(jìn)樣量可能影響f值的因素進(jìn)行考察，結(jié)果表明，f值的波動(dòng)不大（表2）。

2.4 精密度試驗(yàn)

重復(fù)進(jìn)樣6次，測得樂果二級離子掃描色譜峰（125.0/79）平均峰面積為245 997，RSD為0.3%；敵敵畏二級離子掃描色譜峰（185.0/93.0）平均峰面積806 875，RSD為0.7%；毒死蜱二級離子掃描色譜峰（313.9/257.9）平均峰面積511 892，RSD為0.5%，精密度較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

試驗(yàn)測得樂果二級離子掃描色譜峰（125.0/79.0）平均峰面積為246 081，RSD為0.5%；敵敵畏二級離子掃描色譜峰（185.0/93.0）平均峰面積806 593，RSD為0.6%；毒死蜱二級離子掃描色譜峰（313.9/257.9）平均峰面積511 427，RSD為0.4%，表明試驗(yàn)重復(fù)性好。

2.6 樣品溶液穩(wěn)定性

取樣品加標(biāo)溶液，分別在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h進(jìn)樣，結(jié)果表明，樂果二級離子掃描色譜峰（125.0/79.0）面積、敵敵畏二級離子掃描色譜峰（185.0/93.0）面積、毒死蜱二級離子掃描色譜峰（313.9/257.9）面積變化不大，RSD分別為0.9%、0.8%、0.6%，表明穩(wěn)定性良好。

2.7 最低檢出限

取樣品加標(biāo)溶液，按測定條件測得樂果、敵敵畏、毒死蜱的信噪比（S/N）分別為10.72、658.14、853.77，以S/N的3倍計(jì)算最低檢出限、10倍計(jì)算最低定量限。結(jié)果測得樂果、敵敵畏、毒死蜱最低檢出限（以進(jìn)樣量計(jì)）分別為1.39×10-2、2.27×10-4、1.75×10-4 ng；最低定量限（以進(jìn)樣量計(jì)）分別為4.66×10-2、7.59×10-4、5.856×10-4 ng。

2.8 回收率試驗(yàn)

試驗(yàn)計(jì)算出樂果二級離子掃描峰面積和進(jìn)樣量間的回歸方程得：A=615 047m-100.3（n=5，r=0.999 6），按回歸方程A=615 047m-102.4計(jì)算供試品中樂果含量；按校正方程A敵敵畏=615 047mf敵敵畏/樂果-102.4計(jì)算敵敵畏含量，按校正方程A毒死蜱=615 047mf毒死蜱/樂果

-102.4計(jì)算毒死蜱含量結(jié)果，樂果平均回收率為95.4%，RSD為1.5%（表3）；敵敵畏平均回收率為95.0%，RSD為1.1%（表4）；毒死蜱平均回收率為94.7%，RSD為0.9%（表5）。

2.9 樣品測定

分別取3個(gè)批號疊鞘石斛（批號為20161209-1、20161209-2、20161209-3）約50 g，粉碎成末過3號篩，分別精密稱定粉末約1 g，制備樣品溶液，取樣品溶液按測定條件分別進(jìn)樣，記錄圖譜，測得樣品中樂果、敵敵畏、毒死蜱殘留量見表6。

3 討論

當(dāng)色譜條件有細(xì)微改變時(shí)，相對保留時(shí)間有細(xì)微變化，但在該試驗(yàn)中，被測定物質(zhì)的定性主要采用二級離子碎片峰及其豐度比確認(rèn)，所以對相對保留時(shí)間的耐受性沒有進(jìn)行考察。

儀器建議進(jìn)樣體積不超過1 μL，在相對校正因子f值耐受性考察時(shí)，對進(jìn)樣體積0.9、1.0、1.1 μL時(shí)的f進(jìn)行了比較，結(jié)果變化不大。

對多種藥材農(nóng)藥殘留的含量測定進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)由于中藥材含有多種成分，某些成分對測定會有一些干擾，所以在測定具體某一品種時(shí)應(yīng)設(shè)計(jì)具體的試驗(yàn)參數(shù)，并進(jìn)行相應(yīng)方法學(xué)論證。

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