康昌源，王慶奎，王靜波，馮俊超

(1.天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津300384;2.北京市水產(chǎn)技術推廣站，北京300380)

副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌在海水環(huán)境中廣泛存在，是海水養(yǎng)殖魚類常見的致病菌［1－3］，其中遲緩愛德華氏菌和副溶血弧菌還是人畜共患菌。目前，對這幾種致病菌引起的水產(chǎn)動物相關疾病的防治還主要依賴傳統(tǒng)的化學消毒劑、抗生素等［4－5］。這些藥物雖然在動物病害防控方面見效快、效果好，但由于會使致病菌產(chǎn)生耐藥性以及污染水環(huán)境等明顯缺陷，開發(fā)安全高效的新產(chǎn)品或新方法已成為水產(chǎn)疾病防控的熱點。中草藥因其毒副作用小、易降解等特點已成為水產(chǎn)抗病防病的重要研究方向［6］。

肉桂醛(cinnamaldehyde)別稱桂皮醛、桂醛，是樟科植物肉桂的干皮及樹皮經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油(肉桂油)中的主要成分，分子式為C6H5=CH CHCHO，在室溫下為淡黃色油狀物，難溶于水、甘油，易溶于乙醇、乙醚中［7］。肉桂醛具有在動物體內(nèi)代謝快、無殘留、對養(yǎng)殖環(huán)境無污染、病原菌對其不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，被認為是一種新型的綠色、環(huán)境友好型飼料添加劑［8－9］。美國食品和藥物管理局(FDA)認為，肉桂醛是一種安全的食品添加劑［10］。研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛對許多細菌、真菌都具有抑殺作用［11－12］，不僅能脅迫殺傷動物體內(nèi)的致病性大腸桿菌［13］，還能作為防腐劑抑殺食源性致病菌［14］。肉桂醛難溶于水的特性使其無法直接在水體中應用。將肉桂醛制成脂質體后，可極大提高其在水體中的分散性。目前，肉桂醛脂質體(liposome－encapsulated cinnamaldehyde，LEC)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究很少，僅有的1篇研究發(fā)現(xiàn)用LEC藥浴攻毒無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)后的斑馬魚(Danio rerio)能顯著提高斑馬魚的存活率，并能顯著降低攻毒魚體內(nèi)的菌落數(shù)［15］。本試驗比較LEC對副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌的體外抑菌效果，為肉桂醛在水產(chǎn)動物疾病防控中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:試驗所用副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌由本試驗室提供。

主要試劑:蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、肉桂醛(95%)、無水乙醇，均購自日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 營養(yǎng)肉湯 蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，121℃下高壓滅菌15 min，冷卻后用于培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌;培養(yǎng)哈氏弧菌和副溶血弧菌的液體培養(yǎng)基在此基礎上多加10 g海水晶。營養(yǎng)瓊脂:在營養(yǎng)肉湯的基礎上添加20 g的瓊脂粉。經(jīng)活化培養(yǎng)后的菌液用相應的肉湯稀釋至1×108CFU/mL備用。

1.2.2 肉桂醛脂質體(LEC) 參照 Faikoh的方法［15］，配比稍有改動，將40 mg/mL肉桂醛(95%)、體積分數(shù)為7%的液體大豆卵磷脂、體積分數(shù)0.5%的維生素E溶解于5%乙醇中，在磁力加熱攪拌器(Hg－4A)攪拌混勻，混合物用超高壓均質機(JN－10C)處理(壓力為400 bar，流速為10 L/h)3次，獲得肉桂醛脂質化包埋產(chǎn)物LEC。制備空白脂質體(LE)時，用等量的5%乙醇替代肉桂醛。

1.2.3 濾紙片制備 選取吸水性好的優(yōu)質濾紙(由杭州富陽北木漿紙有限公司提供，型號102)若干，用打孔器打成直徑為6 mm的圓形濾紙片，高溫高壓滅菌后備用。

1.2.4 抑菌圈測定 在潔凈工作臺(SW－CJ－ZFD)里進行操作，將肉桂醛與50%乙醇1∶3稀釋后作為第1個濃度，然后用50%乙醇不斷2倍稀釋構成共計5個濃度，每個濾紙片上完全吸收5μL相應濃度的藥液。吸取0.1 mL的菌懸液，用涂抹棒均勻涂布在相應的瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子夾取含有不同濃度肉桂醛溶液的濾紙片，貼在含菌平板上，每個梯度作3個濾紙片。于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，每個抑菌圈在2個垂直方向上測量2次，取平均值。抑菌效果等級劃分參照文獻［16］:抑菌直徑＜8 mm為無抑菌作用;8～10 mm為弱抑菌作用;11～15 mm為中等抑菌作用;≥16 mm為強抑菌作用。

1.2.5 最小抑菌濃度(MIC)試驗［17］采用2倍稀釋法，先將肉桂醛與50%乙醇1∶3稀釋，構成工作液。將工作液不斷2倍稀釋形成共10個梯度用于抑菌研究。取稀釋液0.1 mL加入到裝有0.8 mL液體培養(yǎng)基的試管中，再接入0.1 mL含菌量為108CFU/mL試驗菌的菌懸液，于28℃培養(yǎng)24 h后，從各管取出0.1 mL，分別涂布平板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，觀察有無細菌生長，若有菌落生長，記為陽性(+)，若無菌落生長，記為陰性(－);以無細菌生長的肉桂醛最低濃度為MIC。以添加0.1 mL 50%乙醇不添加肉桂醛成分為陰性對照，以不添加50%乙醇和肉桂醛成分的培養(yǎng)基為空白對照，每種處理作3個平行。

LEC的MIC研究則將LEC作為工作液，用滅菌生理鹽水2倍稀釋共7個濃度作用于3種致病菌。以添加空白脂質體(LE)作為陰性對照，以添加滅菌生理鹽水作為空白對照。其他處理同肉桂醛的抑菌操作。

1.2.6 最小殺菌濃度(MBC)試驗［18］在 MIC的基礎上，從無菌生長的試管中取0.1 mL培養(yǎng)液加入到10 mL液體培養(yǎng)基中，混勻，28℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再用平板涂布法觀察有無細菌生長，無菌生長的最小濃度即為MBC。對照組同MIC試驗，每種處理作3個平行。

2 結果與分析

2.1 肉桂醛和LEC的抑菌直徑

由圖1可知，肉桂醛和LEC對所選的3種菌均有明顯的抑制效果，隨著肉桂醛濃度增大，抑菌圈直徑逐漸增大，抑菌效果更加明顯。遲緩愛德華氏菌的抑菌直徑比另2種菌的抑菌直徑在相同肉桂醛濃度下表現(xiàn)更為明顯，副溶血弧菌的抑菌直徑范圍在3種菌中跨幅最小。進一步分析可知，在肉桂醛組中，濃度為15.62 mg/mL的肉桂醛對副溶血弧菌無抑菌作用，而對哈氏弧菌為弱抑菌作用，對遲緩愛德華氏菌則為中等抑菌作用。肉桂醛濃度為31.25 mg/mL時對副溶血弧菌為弱抑菌作用，而對哈氏為中等抑菌作用，對遲緩愛德華氏菌則為強抑菌作用。濃度為62.50 mg/mL的肉桂醛對副溶血弧菌表現(xiàn)為中等抑菌作用，而對另2種菌則表現(xiàn)為強抑菌作用。肉桂醛濃度在125.00、250.00 mg/mL時對3種菌都表現(xiàn)出強抑菌作用。

在LEC組中，肉桂醛濃度為2.50、5.00 mg/mL時對遲緩愛德華氏菌為弱抑菌作用，對副溶血弧菌和哈氏弧菌均無抑菌作用。濃度為10.00 mg/mL的肉桂醛對副溶血弧菌和哈氏弧菌為弱抑菌作用，濃度為20.00 mg/mL時對這2種菌均為中等抑菌作用;而遲緩愛德華氏菌在這2個肉桂醛濃度下均表現(xiàn)為中等抑菌作用。當肉桂醛濃度在40.00 mg/mL時，肉桂醛對3種菌都表現(xiàn)為強抑菌作用。

2.2 MIC

由表1可知，肉桂醛組 MIC結果中，肉桂醛濃度為7.81 mg/mL時，副溶血弧菌和哈氏弧菌不生長;肉桂醛濃度為1.95 mg/mL時，遲緩愛德華氏菌不生長。說明肉桂醛對副溶血弧菌和哈氏弧菌的最小抑菌濃度為7.81 mg/mL，對遲緩愛德華氏菌的最小抑菌濃度為1.95 mg/mL。

LEC組的 MIC結果(表 2)顯示，肉桂醛濃度為2.50 mg/mL時，副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌不生長;肉桂醛濃度為1.25 mg/mL時，哈氏弧菌不生長。說明LEC中肉桂醛對副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌的最小抑菌濃度為2.50 mg/mL，對哈氏弧菌的最小抑菌濃度為1.25 mg/mL。

2.3 MBC

肉桂醛和LEC均能殺滅副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌。由圖2可知，肉桂醛組中，3種菌對肉桂醛的耐受性不同，哈氏弧菌耐受性最強，最小殺菌濃度為15.62 mg/mL;其次是副溶血弧菌，最小殺菌濃度為7.81 mg/mL;敏感性相對最強的是遲緩愛德華氏菌，最小殺菌濃度為1.95 mg/mL。在LEC試驗組中，肉桂醛對3種菌的最小殺菌濃度均為5 mg/mL。

表1 肉桂醛對3種菌的MIC

表2 LEC對3種菌的MIC

3 討論與結論

將肉桂醛經(jīng)包埋、均質處理制成的脂質體(LEC)，具有易溶于水的優(yōu)良特性。本試驗中，LEC對3種致病菌都有顯著的抑菌、殺菌作用，這為肉桂醛在水體中的應用提供了有益借鑒，擴大了肉桂醛的應用前景。

研究表明，天然植物精油對生產(chǎn)中的許多致病菌都有很好的抑制作用。本試驗中肉桂醛對3種革蘭氏陰性菌都有抑制作用，這與王帆等對大腸桿菌和綠膿桿菌這2種陰性菌的抑菌結果［19］一致。本試驗抑菌直徑結果表明，肉桂醛的抑菌效果與其濃度呈正相關，隨著濃度的增大，肉桂醛對副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌抑菌能力越來越強。研究認為肉桂醛的抑菌作用是由于其具有一定的疏水性，可穿透細胞壁，與細胞膜相互作用，使細胞膜的透過性增強［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同受試菌對肉桂醛和LEC敏感性不同，副溶血弧菌在相同肉桂醛濃度下抑菌直徑相對較小。與肉桂醛相比，LEC能使肉桂醛在更低濃度下即能表現(xiàn)出顯著的抑菌效果。

對比LCE和肉桂醛的MIC和MBC結果可知，相較于遲緩愛德華氏菌而言，副溶血弧菌和哈氏弧菌對LEC表現(xiàn)出更高的敏感性，這可能與弧菌屬和愛德華菌屬的生物構成差異有關，其抑菌機理有待進一步研究。

LEC和肉桂醛對副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌均有明顯的抑菌、殺菌作用，且隨著用藥濃度的增大，抑菌能力增強。LEC在水體致病菌的防控中具有良好的開發(fā)應用前景。