北京市藥品檢驗(yàn)所 中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（102206）江志杰 張光華 劉文杰 高春

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)測(cè)試來(lái)判定實(shí)驗(yàn)室和檢查機(jī)構(gòu)能力的活動(dòng)[1]。它是實(shí)驗(yàn)室的重要的外部質(zhì)量保證手段，能增加客戶(hù)及相關(guān)方對(duì)實(shí)驗(yàn)室出具可靠數(shù)據(jù)的信心[2]。根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版的要求，對(duì)要求無(wú)菌的藥品必須進(jìn)行無(wú)菌檢查，而不同單位的無(wú)菌檢測(cè)能力各不相同或是檢驗(yàn)環(huán)境的差異，可能會(huì)出現(xiàn)同一樣品出具不同的結(jié)果，因此開(kāi)展藥品無(wú)菌檢測(cè)能力驗(yàn)證來(lái)衡量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果準(zhǔn)確性具有重要意義，也為有效控制無(wú)菌藥品的結(jié)果準(zhǔn)確性提供了技術(shù)的保障。為評(píng)價(jià)參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)藥品無(wú)菌的技術(shù)水平和能力，確定和核查實(shí)驗(yàn)室對(duì)于本項(xiàng)目的檢測(cè)能力，提高各參加實(shí)驗(yàn)室對(duì)該類(lèi)測(cè)試項(xiàng)目的檢測(cè)水平，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的進(jìn)一步完善，因此開(kāi)展本次能力驗(yàn)證計(jì)劃。此能力驗(yàn)證屬?lài)?guó)內(nèi)首次組織開(kāi)展，出于保密需要，本次計(jì)劃對(duì)每個(gè)參加實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)賦予一個(gè)唯一的代碼(001～084)，在說(shuō)明與參加實(shí)驗(yàn)室有關(guān)的檢測(cè)結(jié)果和結(jié)果評(píng)價(jià)時(shí)，均以上述代碼表示實(shí)驗(yàn)室。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備 HFsafe-1500 生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）、生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、XG1高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、HEY-SZ18068無(wú)菌隔離器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）等。

1.2 菌液的制備 根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版1101無(wú)菌檢查法項(xiàng)下要求制成黑曲霉?jié)怄咦右海ê咦訑?shù)105cfu/ml），置冰箱儲(chǔ)存，備用。取枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]斜面新鮮培養(yǎng)物加0.9%氯化鈉溶液將菌苔洗下，制成懸液，用吸管將懸液吸出至營(yíng)養(yǎng)瓊脂大斜面（克氏瓶）上，均勻攤布，置33℃培養(yǎng)7d，進(jìn)行革蘭氏染色觀察，確保芽孢含量在85%以上，用滅菌水50ml少量多次洗下孢子，合并洗液至大試管中，制成濃孢子液（含孢子數(shù)105cfu/ml），置冰箱儲(chǔ)存，備用。

1.3 能力驗(yàn)證樣品的制備 樣品為XX藥業(yè)生產(chǎn)的注射用泮托拉唑鈉批號(hào)為17030811共1500支，分為300份，每份由A、B、C、D、E 5支樣品組成，其中三支樣品為無(wú)菌的注射用泮托拉唑鈉，一支樣品人工污染1μl上述細(xì)菌（枯草芽孢桿菌）菌液，一支樣品人工污染1μl上述真菌（黑曲霉）菌液。

1.4 方法學(xué)考察 根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版1101無(wú)菌檢查法項(xiàng)下要求，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉為驗(yàn)證菌，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1.5 樣品穩(wěn)定性和均勻性考察 按CANSGL03:2006[3]的要求，從樣品總體中隨機(jī)抽取20份樣品用于均勻性檢驗(yàn)，采用已驗(yàn)證的薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查；不同的溫度（4℃、25℃、36℃）不同的時(shí)間點(diǎn)（15天、30天、60天）隨機(jī)取10份采用上述已驗(yàn)證的薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查，考察樣品的穩(wěn)定性。

1.6 結(jié)果評(píng)價(jià)原則 3支無(wú)菌樣品和2支有菌樣品的檢驗(yàn)結(jié)果均正確，即與預(yù)期結(jié)果完全一致，判定為滿(mǎn)意結(jié)果；2支有菌樣品中，任意1支檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤，或3支無(wú)菌樣品中，任意1支檢驗(yàn)結(jié)果錯(cuò)誤，即為不滿(mǎn)意結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果 本品與培養(yǎng)基會(huì)形成乳白色沉淀，故采用薄膜過(guò)濾法，用0.1%蛋白胨水溶液300ml沖洗一次，與對(duì)照管比較，含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)。故確定的檢驗(yàn)方法如下：取本品1支，用0.9%氯化鈉注射液5ml溶解后，全量轉(zhuǎn)移至0.9%氯化鈉注射液100ml中，采用全封閉無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)濾培養(yǎng)器（三聯(lián)）全部過(guò)濾，用0.1%蛋白胨水300ml沖洗1次，每筒沖洗100ml，將胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml加入其中一筒，置25℃培養(yǎng)14天；其余兩筒均加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100ml，其中一筒加金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照，置33℃培養(yǎng)14天，逐日觀察。

2.2 樣品均勻性和穩(wěn)定性考察結(jié)果 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，0時(shí)的無(wú)菌樣品均無(wú)菌生長(zhǎng)，與已知結(jié)果（應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)）一致；有菌樣品均有菌生長(zhǎng)，與已知結(jié)果（應(yīng)有菌生長(zhǎng)）一致；此外，無(wú)菌的樣品分別在4℃、25℃、36℃不同的時(shí)間點(diǎn)取樣采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查，結(jié)果均無(wú)菌生長(zhǎng)；有菌的樣品分別在4℃、25℃、36℃不同的時(shí)間點(diǎn)取樣采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查，結(jié)果顯示均有菌生長(zhǎng)，作為定性樣品，符合均勻性和穩(wěn)定性的要求。

2.3 能力驗(yàn)證結(jié)果 本次能力驗(yàn)證共有84家實(shí)驗(yàn)室參加，全部提交了檢測(cè)報(bào)告，其中結(jié)果不滿(mǎn)意有8家，從不滿(mǎn)意結(jié)果的檢查報(bào)告中顯示，假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果均存在，具體結(jié)果見(jiàn)附表。

2.4 不滿(mǎn)意結(jié)果原因分析 通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室提供的檢測(cè)報(bào)告的核查，對(duì)可能造成上述8家不滿(mǎn)意結(jié)果的原因分析如下。

①無(wú)菌檢查試驗(yàn)環(huán)境監(jiān)控不到位，試驗(yàn)人員無(wú)菌操作意識(shí)不夠強(qiáng)。CNAS T0781-058實(shí)驗(yàn)室兩支陰性樣品均報(bào)“檢出”，可能是由于該實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌檢查環(huán)境不符合要求，操作人員的無(wú)菌操作意識(shí)不夠強(qiáng)而導(dǎo)致的。從其原始記錄中還發(fā)現(xiàn)，該兩瓶陰性樣品中檢出的菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌。CNAS T0781-037實(shí)驗(yàn)室中的一支陰性樣品報(bào)“檢出”，從其原始記錄中發(fā)現(xiàn)，所有上報(bào)有菌生長(zhǎng)的樣品均為第一天就生長(zhǎng)，而含黑曲霉的陽(yáng)性樣品，至少需要培養(yǎng)48小時(shí)以上才能觀察到有菌生長(zhǎng)，即含黑曲霉的陽(yáng)性樣品第一天生長(zhǎng)的菌并非是黑曲霉，而是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中污染的微生物，故分析可能該實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌檢查環(huán)境不符合要求或操作人員的無(wú)菌操作意識(shí)不夠強(qiáng)所致。建議對(duì)檢出菌進(jìn)行鑒定溯源，查找原因。

②培養(yǎng)基的質(zhì)量不佳導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。含枯草芽孢桿菌的陽(yáng)性樣品在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天后均應(yīng)生長(zhǎng)良好，而CNAS T0781-017實(shí)驗(yàn)室和CNAS T0781-062實(shí)驗(yàn)室的含枯草芽孢桿菌的陽(yáng)性樣品在改良馬丁中未生長(zhǎng)，CNAS T0781-008實(shí)驗(yàn)室是在第五天才發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng)，可能是該實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)基的質(zhì)量或滅菌條件不合適導(dǎo)致培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)有所下降所致，靈敏度可能不符合藥典要求，從而影響枯草芽孢桿菌和黑曲霉在改良馬丁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度或檢出率。從CNAS T0781-017實(shí)驗(yàn)室提供的培養(yǎng)基適用性檢查記錄中可以發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂接觸碟和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的回收率最高才80%，有的僅為70.3%，盡管符合藥典要求（大于70%），但其靈敏度已有所下降，且培養(yǎng)基開(kāi)啟日期為2013年11月20日，時(shí)間較長(zhǎng)，可能影響其培養(yǎng)基質(zhì)量，從而導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。

③試驗(yàn)記錄可能有誤，結(jié)果出現(xiàn)混淆。CNAS T0781-011實(shí)驗(yàn)室一支陽(yáng)性樣品B（黑曲霉），上報(bào)結(jié)果為“未檢出”；一支陰性樣品D，上報(bào)結(jié)果為“檢出”。通過(guò)原始記錄分析發(fā)現(xiàn)，其報(bào)檢出的陰性樣品D僅改良馬丁培養(yǎng)基中有菌生長(zhǎng)，且是第三天開(kāi)始生長(zhǎng)，與黑曲霉的生長(zhǎng)特性相吻合，是在試驗(yàn)或記錄過(guò)程中將樣品D與樣品B混淆所致。

3 結(jié)論

CNAS 在CNAS RL02:2011中規(guī)定了實(shí)驗(yàn)室應(yīng)將能力驗(yàn)證作為重要的外部質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，對(duì)參加了CNAS 組織及其承認(rèn)的能力驗(yàn)證活動(dòng)且有穩(wěn)定滿(mǎn)意表現(xiàn)的機(jī)構(gòu)，在CNAS 的各類(lèi)評(píng)審中可根據(jù)情況簡(jiǎn)化相關(guān)項(xiàng)目的能力確認(rèn)過(guò)程[4]。能力驗(yàn)證工作的重要性已得到社會(huì)各界的廣泛認(rèn)可，鼓勵(lì)更多的實(shí)驗(yàn)室參加各種能力驗(yàn)證活動(dòng)，可以提高我國(guó)藥品檢測(cè)質(zhì)量控制整體水平和實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力。通過(guò)本次能力驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)許多實(shí)驗(yàn)室從環(huán)境、人員、操作SOP、培養(yǎng)基等許多地方需要改進(jìn)，為避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，筆者建議加強(qiáng)對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)培訓(xùn)，熟悉無(wú)菌檢測(cè)的檢驗(yàn)方法，嚴(yán)格把握檢測(cè)過(guò)程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)和無(wú)菌意識(shí)；加強(qiáng)對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)量的控制，對(duì)每一批培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查，同時(shí)對(duì)消毒過(guò)程要嚴(yán)格監(jiān)控，防止消毒不徹底或溫度過(guò)高等，并做好記錄，對(duì)放置時(shí)間太久已開(kāi)啟的干粉培養(yǎng)基，盡量不要使用，以免影響其質(zhì)量；對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控，對(duì)環(huán)境中收集的菌進(jìn)行染色、分離、純化、鑒定，建立實(shí)驗(yàn)室的菌種庫(kù)，將樣品中分離的菌與環(huán)境中分離的菌進(jìn)行溯源分析，進(jìn)行同源性比較，采用多種方法對(duì)可疑結(jié)果進(jìn)行判定。

附表 8家不滿(mǎn)意實(shí)驗(yàn)室上報(bào)的具體結(jié)果