LAMP和熒光定量PCR檢測(cè)食品中致病微生物的對(duì)比分析

廣州市黃埔區(qū)疾病預(yù)防控制中心（510700）鐘秀茵 楊曉斌 劉鈺釵 何湘鵑

附圖1 LAMP反應(yīng)后可見(jiàn)沉淀，1、2為沙門(mén)菌，3、4為大腸埃希菌，5、6、7為金黃色葡萄球菌。LAMP反應(yīng)后凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)連續(xù)階梯狀條帶，M為DNA標(biāo)記，1、2為沙門(mén)菌，3、4為大腸埃希菌，5、6、7為金黃色葡萄球菌

附圖2 熒光定量PCR反應(yīng)后目的基因溶解曲線

食源性疾病主要是指食品中致病微生物進(jìn)入人體中而引發(fā)的感染性或中毒性疾病[1]。本次研究采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)各類(lèi)食物標(biāo)本中的3種致病微生物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 基本資料 選取攜帶有致病微生物的50份米粉、50份污水及50份罐頭作為檢測(cè)樣本，分別在檢測(cè)樣本中接種濃度為10cfu/ml的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌等菌株（均由本實(shí)驗(yàn)室保存，并接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)18小時(shí)后，反復(fù)轉(zhuǎn)接3次后即可作為備用）各1ml，其中，米粉10g（雀巢高蛋白奶麥粉、鐵鋅鈣營(yíng)養(yǎng)米粉、魚(yú)肉蔬菜營(yíng)養(yǎng)米粉等），污水樣本取自本地區(qū)湖水，污水需稱(chēng)量7ml，罐頭10g（亨氏水果泥、蔬菜骨泥、三文魚(yú)番茄罐頭等）。

1.2 方法 采用LAMP技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)對(duì)檢測(cè)樣本中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果。

附表 LAMP與熒光定量PCR對(duì)各樣本致病微生物的檢測(cè)結(jié)果比較（n，%）

1.2.1 LAMP檢測(cè) 試劑及儀器分別為DNA抽提試劑盒、化學(xué)試劑（包括MgSO4、NH4SO4、KCI溶液等）、凝膠電泳儀，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌各設(shè)計(jì)4條引物（即F3、B3、FIP、BIP），合成于上海生物工程公司；在消毒樣品包裝的開(kāi)啟和取樣勺后，稱(chēng)取藥品，加入蒸餾水90ml后混勻，并培養(yǎng)24h，將樣品溶液置于肉湯中，混勻培養(yǎng)24h，隨后取增菌液500μl置于無(wú)菌離心管，離心后棄上清液，加入80μl核酸提取液，沸水浴10min后冷卻，再離心2min取上清液為后續(xù)反應(yīng)模版，使用LAMP對(duì)上清液進(jìn)行擴(kuò)增，孵育1小時(shí)后在80℃下孵育5min，結(jié)束反應(yīng)，設(shè)置對(duì)照。反應(yīng)管內(nèi)加入SYBR GreenI 1μl，混勻后于黑色背景下反應(yīng)觀察。陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液為綠色、陰性為橘色，則檢測(cè)結(jié)果有效，在此前提下樣品反應(yīng)液為綠色，則為陽(yáng)性[2]。

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè) 試劑及儀器分別為DNA抽提試劑盒、定量反應(yīng)配套試劑盒、核酸蛋白分析儀、定量聚合酶鏈反應(yīng)儀，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的引物設(shè)計(jì)采用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，金黃色葡萄球菌引物正向、反向基因序列分別為CATTGGCCAAGCGAGACGAAC、AAAGGGCAAGACGCAAAGAGGT，大腸埃希菌引物正向、反向基因序列分別為T(mén)GATAGCTGCACTCGAATCC、GTAGCCTATAACGTCATGCC，沙門(mén)菌引物正向、反向基因序列分別為T(mén)CATGGGACCCTCATTGGATCC、GTGTTTTTCGCCACGAACGCCCAT；定量PCR擴(kuò)增采用定量反應(yīng)配套試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，擴(kuò)增反應(yīng)采用二步法進(jìn)行，先在95℃下預(yù)變性反應(yīng)10min，再在95℃下擴(kuò)增20s，在60℃下反應(yīng)1min，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，再采用DNA抽提試劑盒對(duì)細(xì)菌的總DNA進(jìn)行提取，如凝膠電泳結(jié)果中可見(jiàn)各致病菌的目的條帶即為陽(yáng)性，反之則為陰性[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料（n,%）進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測(cè)結(jié)果 成功建立檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的LAMP，說(shuō)明LAMP對(duì)致病微生物的檢測(cè)靈敏度較高；LAMP反應(yīng)后肉眼可見(jiàn)明顯綠色，凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)連續(xù)階梯狀條帶（見(jiàn)附圖1），說(shuō)明其引物特異性均較為良好。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 成功建立檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的熒光定量PCR，說(shuō)明其對(duì)致病微生物的檢測(cè)靈敏度較高；熒光定量PCR反應(yīng)后凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)目的條帶（金黃色葡萄球菌目的條帶大小為484bp，大腸埃希菌目的條帶大小為662bp，沙門(mén)菌目的條帶大小為284bp），目的基因溶解曲線（見(jiàn)附圖2），說(shuō)明其引物特異性均較為良好。

2.3 LAMP與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果比較熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)三類(lèi)樣本中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌檢出率均高于LAMP檢測(cè)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)附表。

3 討論

食品微生物檢驗(yàn)是食品安全檢查的重要環(huán)節(jié)，通過(guò)對(duì)食品中的致病微生物進(jìn)行檢驗(yàn)，可有效檢出食品中的致病微生物。食品中的致病微生物主要為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌，而采取何種檢測(cè)技術(shù)對(duì)其有效檢出尚有待探討。

LAMP技術(shù)是近年來(lái)在食源性致病微生物檢測(cè)中應(yīng)用較多的一種技術(shù)，主要是利用特殊性能的DNA聚合酶設(shè)計(jì)引物，引物在靶序列DNA區(qū)可進(jìn)行雜交，合成互補(bǔ)鏈，進(jìn)而生成DNA產(chǎn)物，通過(guò)肉眼可對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，同時(shí)，由于LAMP反應(yīng)條件僅需60℃恒溫條件，無(wú)需特殊的儀器設(shè)備，僅需溫度循環(huán)儀器設(shè)備即可，其操作較為便利，結(jié)果判讀較為方便[4]。熒光定量PCR技術(shù)是一種新型的微生物檢驗(yàn)技術(shù)，在食品微生物檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，由于部分病原微生物具有高度變異性，在檢驗(yàn)過(guò)程中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而熒光定量PCR技術(shù)可對(duì)病原微生物進(jìn)行定量檢測(cè)，從而可有效規(guī)避其假陽(yáng)性結(jié)果，檢測(cè)準(zhǔn)確性較高[5]。本次研究中，LAMP、熒光定量PCR均成功建立金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌檢測(cè)，說(shuō)明二者對(duì)致病微生物的檢測(cè)靈敏度較高，且LAMP反應(yīng)后可見(jiàn)明顯渾濁或沉淀，熒光定量PCR反應(yīng)后可見(jiàn)目的基因溶解曲線呈單一曲線，說(shuō)明二者引物的特異性均較為良好。此外，本次研究還發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)三類(lèi)樣本中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌檢出率均高于LAMP檢測(cè)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這提示我們這兩種檢測(cè)技術(shù)均具有較高的準(zhǔn)確性，可將二者結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，LAMP技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)用于食品中致病微生物檢測(cè)均具有良好的檢測(cè)效果，具有其各自?xún)?yōu)勢(shì)，在實(shí)際工作中，應(yīng)將二者結(jié)合進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，以提高食品中致病微生物的檢出率，促進(jìn)食品安全。