雙啟動(dòng)子調(diào)控β-半乳糖苷酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及表征分析

趙海麗 呂素芳

摘要： 本試驗(yàn)的目的是擴(kuò)增得到β-半乳糖苷酶基因啟動(dòng)子序列和β-半乳糖苷酶基因并反向插入pET32a載體中，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分析β-半乳糖苷酶基因在雙啟動(dòng)子序列調(diào)控下的表達(dá)特征。

關(guān)鍵詞： 大腸桿菌;β-半乳糖苷酶基因;表達(dá)載體

中圖分類號(hào)： Q756?? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?? ?文章編號(hào)： 1672-9129（2018）09-0078-01

Abstract： ?the purpose of this study was to obtain the expression characteristics of the lion-galactosidase gene promoter sequence and the lion-galactosidase gene through the reverse insertion of the pET32a vector， construct the shuttle plasmid expression vector， and conduct the induced expression， and analyze the expression characteristics of the lion-galactosidase gene under the regulation of the double promoter sequence.

Keywords： escherichia coli;β-Galactosidase gene;Expression vector

β-半乳糖苷酶，又稱β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，廣泛存在于各種動(dòng)物﹑植物及微生物中。β-半乳糖苷酶能催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷鍵發(fā)生水解，還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷鍵結(jié)構(gòu)特異性，可作為乳糖降解和雙糖合成催化劑，并具有水解生物體內(nèi)儲(chǔ)存的多糖和半乳糖殘基，引起血型轉(zhuǎn)化等生理功能[1]，而受到人們廣泛關(guān)注，成為生物化學(xué)和酶催化化學(xué)的重要研究課題。β-半乳糖苷酶的應(yīng)用有著悠久的歷史，最初在食品工業(yè)中用來降解乳糖含量以滿足乳糖不耐癥癥狀患者的需要，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，它越來越多的應(yīng)用于生物技術(shù)、化學(xué)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料。

（1）菌株和克隆載體 豬大腸桿菌987P（登記號(hào)C83710）菌種，pET32a 載體。

（2）工具酶與試劑盒 各種限制性內(nèi)切酶（NheⅠ、XbaⅠ）、dNTP、PCR Buffer 、Taq DNA聚合酶、RNAase、 DL15000、DL2000、IPTG均購自TaKaRa生物公司;DNA回收試劑盒購自大連寶生物工程（大連）有限公司。其他生化試劑均為化學(xué)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

（1）總DNA的快速提取 挑取單菌落到1.5ml離心管內(nèi)，加20μl雙蒸水后混勻，95℃水浴10min，-20℃10min，于4℃、12000rpm離心2min，取上清備用。

（2）β-半乳糖苷酶基因的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系：模板1 μl，10×PCR buffer2.5μl，dNTP 3μl，上、下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶 0.5μl，ddH2O 16μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)，最后延伸10min。取5μl PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

（3） PCR產(chǎn)物及pET32a雙酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化及鑒定：參照分子克隆。

（4） 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)及SDS-PAGE檢測：常規(guī)操作。

（5）表達(dá)產(chǎn)物的劃線鑒定 利用涂布36μL 20mg/ml X-gal，34μL 24mg/ml IPTG LB固體選擇培養(yǎng)基和涂布36μL 20mg/ml X-gal固體選擇培養(yǎng)基進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-半乳糖酶苷基因的PCR 挑取987P細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后在3064bp處有明亮條帶，為目的條帶，說明擴(kuò)增成功。大量擴(kuò)增后進(jìn)行酶切回收。

2.2 重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定及雙酶切鑒定 經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑取白色菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果均擴(kuò)增出3064bp大小目的片段，選取兩個(gè)菌落進(jìn)行大量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行Nhe Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切后，出現(xiàn)一條5900bp載體片段和一條3064bp目的片段，均為陽性重組子，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo) 選取陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行活化培養(yǎng)，按1/100接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)數(shù)期時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)，在不同時(shí)期取樣進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果證明表達(dá)成功，在120 KD左右為目的蛋白，誘導(dǎo)時(shí)間不同對(duì)于β-半乳糖苷酶表達(dá)量影響不大。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的劃線鑒定 將陽性重組質(zhì)粒培養(yǎng)液劃線接種于涂布X-gal， IPTGLB固體選擇培養(yǎng)基和涂布X-gal固體選擇培養(yǎng)基，設(shè)空白對(duì)照，37℃溫箱中培養(yǎng)過夜，得到菌株;在含有X-gal和誘導(dǎo)物IPTG（A）的培養(yǎng)基上菌株形成明顯的藍(lán)色菌落;在只含有X-gal的培養(yǎng)基（B）中形成不明顯的藍(lán)色菌落。結(jié)果表明：陽性菌株均能在含有IPTG誘導(dǎo)物的情況下高效表達(dá)β-半乳糖苷酶，在不存在IPTG誘導(dǎo)物的情況下三株野生菌株只產(chǎn)生少量的β-半乳糖苷酶。

3 討論

目前分子生物學(xué)與基因克隆工作中，常以耐藥性基因作為克隆篩選的標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)克隆轉(zhuǎn)化子進(jìn)行正向篩選，而且可使含耐藥性基因的質(zhì)粒在抗生素存在的情況下保持穩(wěn)定。然而其缺點(diǎn)是顯而易見的，在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)中應(yīng)用的菌株，如果含有位于質(zhì)粒上的耐藥性基因，有可能造成耐藥性基因的擴(kuò)散，而以非抗生素抗性為選擇標(biāo)記的載體系統(tǒng)可以克服以上不足[3]。β-半乳糖酶基因是細(xì)菌的持家基因和營養(yǎng)因子，所以β-半乳糖苷酶基因也可以作為質(zhì)粒載體穩(wěn)定表達(dá)的選擇標(biāo)記，這在減少畜產(chǎn)品中的藥物殘留以及保護(hù)微生態(tài)環(huán)境均具有重要的意義。這樣不但賦予了β-半乳糖酶基因的新用途，更使質(zhì)粒達(dá)到了“食品級(jí)”的要求，從而更加廣泛的應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)與人類保健。

參考文獻(xiàn)：

[1]王春鳳，秦澤榮，孫哲，等.以ThyA基因?yàn)檫x擇壓力非抗性質(zhì)粒載體的構(gòu)建.微生物學(xué)通報(bào).2001，28（2）：42—46

[3]孫哲，王春鳳，汪明.大腸桿菌β-半乳糖酶苷基因缺陷型菌珠的篩選.中國獸醫(yī)雜志.2004.40（2）：12—14