兩種谷氨酰胺酶的酶學(xué)特性研究

盧慧茵，王煒，崔春

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510641)

谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)屬于水解酶類，可催化L-谷氨酰胺水解生成L-谷氨酸和氨[1]。在食品工業(yè)特別是醬油釀造工業(yè)中，谷氨酰胺酶具有重要的應(yīng)用價值。在醬油的釀造過程中，向醬油曲料中添加一定量的谷氨酰胺酶，利用其水解活力，將體系中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，有助于提高醬油鮮味，從而得到品質(zhì)更高的醬油[2]。此外，谷氨酰胺酶還被應(yīng)用于米谷蛋白的脫酰胺，脫酰胺后的米谷蛋白各種功能特性如起泡性、溶解性等都有了明顯的改善[3]。

谷氨酰胺酶廣泛分布于細(xì)菌、酵母、真菌等微生物中以及哺乳動物等真核生物中。目前已有報道多種微生物能產(chǎn)谷氨酰胺酶，如Bacilluscirculans[4]，Pseusomonasaeruginosa[5]，Trichodemakoningii[6]等細(xì)菌菌株，Pichia[7]，Debaryomycesspp.[8]等酵母菌株，Tilachlidiumhumicola[9]，Verticilliummalthousei[10]等真菌菌株。有研究證明，硝基還原假單胞菌、米曲霉等菌株來源的谷氨酰胺酶除具有水解活性外，還具有轉(zhuǎn)肽酶活力，它能催化γ-谷氨酰單體水解，轉(zhuǎn)移并形成γ-谷氨酰肽[11,12]，如以谷氨酰胺、乙胺為底物，在谷氨酰胺酶的催化下合成茶氨酸[13]。

盡管目前對不同菌株來源的谷氨酰胺酶的水解酶特性已有系統(tǒng)性深入研究，但同一微生物菌株來源不同企業(yè)生產(chǎn)的谷氨酰胺酶的酶學(xué)特性如pH、溫度、鹽含量等仍有較大差異。本文選取了2種解淀粉芽孢桿菌來源的谷氨酰胺酶，對比分析不同因素對其水解活力和轉(zhuǎn)肽酶活力的影響，旨在為谷氨酰胺酶在食品工業(yè)中更好的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

磷酸、硼酸：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；冰乙酸、氯化鈉、一水合檸檬酸：上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；硫酸：北京化學(xué)試劑廠；無水氯化鋰：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；十二水磷酸氫二鈉：廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

雙甘肽：麥克林試劑；銨離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：上海般特有限公司；谷氨酰胺：購于湖北華陽醫(yī)藥有限公司；谷氨酰胺酶：市售。

溶液配制：0.2 mol/L NaOH溶液，Britton-Ronbinson緩沖液A，0.05 mol/L 磷酸、硼酸、醋酸混合酸溶液，根據(jù)所需pH值的緩沖液，用0.2 mol/L NaOH溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，得到pH為2.0，4.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，12.0的系列緩沖液；10%三氯乙酸溶液；20%氯化鋰溶液(20 g無水氯化鋰溶于pH 2.0的硫酸溶液中)；pH 3.0和pH 7.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。

攜帶型水質(zhì)測量儀(321-NH4)、銨離子選擇電極 上海般特股份有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4) 江陰市保利科研器械有限公司；pH計(雷磁PHS-3E) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 探究不同pH對谷氨酰胺酶水解活性的影響

酶活的測定方法參考崔春等[14]的方法，略加修改。取谷氨酰胺酶0.01 g于3 mL不同pH的系列Britton-Ronbinson緩沖液中，加入0.01 g反應(yīng)底物谷氨酰胺，于37 ℃精確保溫10 min，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，將反應(yīng)液以pH 6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化鋰溶液，用銨離子選擇電極進(jìn)行銨離子含量測定，記為CH。

1.2.2 探究谷氨酰胺酶在不同pH中的穩(wěn)定性

酶活的測定方法參考崔春等的方法，略加修改。取谷氨酰胺酶0.01 g于3 mL不同pH的系列Britton-Ronbinson緩沖液中保溫16 h。取1 mL 經(jīng)處理的酶溶液，加入2 mL pH 9.0 Britton-Ronbinson緩沖液，0.01 g反應(yīng)底物谷氨酰胺，于37 ℃精確保溫10 min，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，將反應(yīng)液以pH 6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化鋰溶液，用銨離子選擇電極進(jìn)行銨離子含量測定，記為CH。

1.2.3 探究不同溫度對谷氨酰胺酶水解活性的影響

取谷氨酰胺酶0.01 g于3 mL pH 9.0 Britton-Ronbinson緩沖液中，加入0.01 g反應(yīng)底物谷氨酰胺，于30，35，40，45，50 ℃精確保溫10 min，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，將反應(yīng)液以pH 6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化鋰溶液，用銨離子選擇電極進(jìn)行銨離子含量測定，記為CH。

1.2.4 探究谷氨酰胺酶在不同溫度中的穩(wěn)定性

取谷氨酰胺酶0.01 g于3 mL pH 9.0 Britton-Ronbinson緩沖液中，于30，35，40，45，50 ℃精確保溫1 h。加入0.01 g反應(yīng)底物谷氨酰胺，于37 ℃精確保溫10 min，加入1 mL三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，將反應(yīng)液以pH 6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化鋰溶液，用銨離子選擇電極進(jìn)行銨離子含量測定，記為CH。

1.2.5 探究不同鹽含量對谷氨酰胺酶水解活性的影響

準(zhǔn)確稱取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g氯化鈉，用pH 9.0 Britton-Ronbinson緩沖液定容至10 mL，得到鹽含量分別為5%，10%，15%，20%，25%的緩沖液。取谷氨酰胺酶0.01 g，加入3 mL上述緩沖液中，加入0.01 g反應(yīng)底物谷氨酰胺，于37 ℃精確保溫10 min，加入1 mL三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，將反應(yīng)液以pH 6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化鋰溶液，用銨離子選擇電極進(jìn)行銨離子含量測定，記為CH。

1.2.6 探究不同因素對谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)肽活性的影響

探究pH對谷氨酰胺酶及其穩(wěn)定性的影響，溫度對谷氨酰胺酶及其穩(wěn)定性的影響，鹽含量對谷氨酰胺酶的影響，上述變量的控制分別參考1.2.1，1.2.2，1.2.3，1.2.4，1.2.5。取谷氨酰胺酶0.01 g，加入3 mL上述緩沖液中，加入反應(yīng)底物谷氨酰胺和雙甘氨肽各0.01 g，于37 ℃精確保溫10 min，加入1 mL三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，將反應(yīng)液以pH 6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液定容至10 mL，加入0.4 mL 20%氯化鋰溶液，用銨離子選擇電極進(jìn)行銨離子含量測定，記為CT，則δC=CT-CH即可表征谷氨酰胺酶的轉(zhuǎn)肽活性。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果為3組平行樣品的平均值，表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，使用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用SPSS 2.0對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣本T檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對谷氨酰胺酶催化活性及其穩(wěn)定性的影響

圖1 pH對谷氨酰胺酶水解和轉(zhuǎn)肽相對酶活的影響Fig.1 The effect of different pH values on relative activity of hydrolysis or transpeptidation of glutaminase

由圖1可知，谷氨酰胺酶催化水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的最適pH不相同。對于廠家一谷氨酰胺酶來說，水解反應(yīng)的最適pH為7.0，在pH范圍為7.0～9.0之間均保持較高的水解活性，當(dāng)pH大于12.0時，水解活性急劇下降直至失活，這和Alexandra W Z等[15]對鼠李糖乳桿菌生產(chǎn)的谷氨酰胺酶的研究結(jié)果一致；而轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的最適pH為10.0，在堿性條件下能保持較高的轉(zhuǎn)肽活性，但當(dāng)pH高于12.0時，轉(zhuǎn)肽活性也表現(xiàn)出大幅度的下降。對于廠家二谷氨酰胺酶來說，水解反應(yīng)的最適pH為7.0，當(dāng)pH高于7.0時，水解活性開始下降；轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的最適pH為9.0。谷氨酰胺酶的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)是其功能的基礎(chǔ)，pH的變化會使維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的作用力發(fā)生變化，影響其結(jié)構(gòu)，從而影響其催化的反應(yīng)類型[16]。

圖2 pH與谷氨酰胺酶穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.2 The relationship between pH and stability of glutaminase

由圖2可知，2種谷氨酰胺酶在較大的pH范圍內(nèi)(6.0～10.0)均能保持一定的活性，這比Pichaguilliermondii所產(chǎn)谷氨酰胺酶的pH穩(wěn)定范圍更廣泛，該酵母所產(chǎn)谷氨酰胺酶在酸性條件下較穩(wěn)定，當(dāng)pH高于4.5時，酶活開始快速下降，這可能是因為谷氨酰胺酶的產(chǎn)酶微生物均是解淀粉芽孢桿菌。

2.2 溫度對谷氨酰胺酶催化活性及其穩(wěn)定性的影響

圖3 溫度對谷氨酰胺酶水解和轉(zhuǎn)肽相對酶活的影響Fig.3 The effect of different temperatures on relative activity of hydrolysis or transpeptidation of glutaminase

由圖3可知，溫度對2種谷氨酰胺酶反應(yīng)的影響是一致，隨著溫度的升高，相對酶活逐漸升高，在最適溫度下相對酶活達(dá)到最高，隨后急劇下降。對于廠家一谷氨酰胺酶而言，水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的最適溫度為50 ℃，這和Moriguchi等[17]從藤黃微球菌中分離出來的2種谷氨酰胺酶以及康維民等[18]從枯草桿菌中分離的谷氨酰胺酶的最佳反應(yīng)溫度一致，但和Klein等[19]從芽孢桿菌中分離的谷氨酰胺酶的最適反應(yīng)溫度(37 ℃)不相同，其原因可能是實驗過程中的保溫時間不一致。由圖3也可知，溫度對廠家二谷氨酰胺酶的活性影響更明顯，該谷氨酰胺酶的最適溫度為45 ℃，當(dāng)溫度從30 ℃升高到45 ℃時，相對水解酶活從43.54%升高到100%，轉(zhuǎn)肽相對酶活更是從9.44%升高到100%，當(dāng)溫度超過45 ℃時，相對酶活則急劇下降。

圖4 谷氨酰胺酶穩(wěn)定性與溫度的關(guān)系Fig.4 The relationship between temperature andstability of glutaminase

由圖4可知，在不同的溫度下，廠家一谷氨酰胺酶的水解和轉(zhuǎn)肽酶活力均比廠家二谷氨酰胺酶高。就酶的穩(wěn)定性而言，在不同溫度下保溫1 h后，廠家一谷氨酰胺酶在30～50 ℃之間都能保持較高的酶活，即使在50 ℃也能保持58.39%的相對酶活，Aryuman等測得的谷氨酰胺酶的溫度穩(wěn)定范圍較低(25～37 ℃)，實驗中廠家二谷氨酰胺酶的溫度穩(wěn)定范圍較窄(30～40 ℃)，這可能都與產(chǎn)酶的菌種不同有關(guān)。

2.3 鹽含量對谷氨酰胺酶催化活性的影響

圖5 鹽含量對谷氨酰胺酶水解和轉(zhuǎn)肽相對酶活的影響Fig.5 The effect of concentration of NaCl on relative activity of hydrolysis or transpeptidation of glutaminase

由圖5可知，對于水解活性而言，谷氨酰胺酶具有一定的耐鹽性，廠家一谷氨酰胺酶在鹽含量達(dá)到15%時仍能保持78.41%的相對酶活，廠家二谷氨酰胺酶也能保持72.73%的相對酶活，這與谷氨酰胺酶的結(jié)構(gòu)有關(guān)，Yoshimune等研究表明谷氨酰胺酶片段C端領(lǐng)域是1個含有81個氨基酸的片段，當(dāng)鹽濃度超過1.7 mol/L時，該片段會發(fā)生構(gòu)型變化，從而使谷氨酰胺酶具有一定的耐鹽性[20,21]。但對于轉(zhuǎn)肽活性而言，隨著鹽含量增加，其活性不斷下降，表明谷氨酰胺酶在低鹽條件下才能表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)肽活力。

3 結(jié)論

谷氨酰胺酶因具有催化水解和轉(zhuǎn)肽2種功能越來越受到關(guān)注。本文的結(jié)果表明廠家一谷氨酰胺酶催化水解反應(yīng)的最適pH為7.0，最適溫度為50 ℃，催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的最適pH為10.0，最適溫度為50 ℃，在較寬的pH(6.0～10.0)和溫度范圍(30～50 ℃)內(nèi)均能保持較高的酶活；廠家二谷氨酰胺酶催化水解反應(yīng)的最適pH為7.0，最適溫度為45 ℃，催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的最適pH為9.0，最適溫度為45 ℃，在pH 6.0～10.0 和溫度30～40 ℃范圍內(nèi)可保持一定的酶活。結(jié)果還表明谷氨酰胺酶表現(xiàn)水解活性時具有一定的耐鹽性，但表現(xiàn)轉(zhuǎn)肽活性時，酶活會隨著反應(yīng)體系中鹽含量的增加而下降。對比2種谷氨酰胺酶可以發(fā)現(xiàn)，不論是水解活性還是轉(zhuǎn)肽活性，在不同的pH、溫度或是鹽含量下，廠家一谷氨酰胺酶的酶活力總是高于廠家二谷氨酰胺酶的酶活力，并且后者的穩(wěn)定性較差，由此可見，廠家一谷氨酰胺酶更適合于工業(yè)生產(chǎn)。本文從pH、溫度、鹽含量3個因素出發(fā)，探究了其對谷氨酰胺酶水解活性和轉(zhuǎn)肽活性的影響，旨在為谷氨酰胺酶的實際應(yīng)用提供一些理論指導(dǎo)。