生脈注射液聯(lián)合長(zhǎng)春新堿對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖影響的研究

伊雅淞 鞠增睿 韓呼日查 李宏遠(yuǎn) 侯毅鞠

摘 要：目的：通過對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞G292的培養(yǎng)，研究生脈注射液聯(lián)合長(zhǎng)春新堿對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步研究對(duì)抗癌細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。方法：培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞G292，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用不同濃度的生脈注射液，長(zhǎng)春新堿，生脈注射液聯(lián)合長(zhǎng)春新堿作用于人骨肉瘤細(xì)胞G292。加藥培養(yǎng)48小時(shí)后，顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，MTT法測(cè)定，藥物敏感性檢測(cè)。結(jié)果：細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用；MTT法結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用抑制率高于長(zhǎng)春新堿抑制率；藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示生脈注射液聯(lián)合長(zhǎng)春新堿作用效果為相加作用。結(jié)論：生脈注射液聯(lián)合長(zhǎng)春新堿用藥對(duì)細(xì)胞的抑制作用比單獨(dú)用藥更明顯，且作用效果為相加作用。

關(guān)鍵詞：人骨肉瘤細(xì)胞；長(zhǎng)春新堿；生脈注射液；聯(lián)合用藥

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2018）17-0200-02

長(zhǎng)春新堿（VCR）是夾竹桃科植物長(zhǎng)春花中提取出的生物堿，針對(duì)抗腫瘤細(xì)胞具有良好作用[1]。生脈注射液（SM）主要成分為紅參，麥冬，五味子。生脈注射液功能主治心悸，氣短休克等癥狀[2]。實(shí)驗(yàn)以人骨肉瘤G292細(xì)胞株為受試對(duì)象，研究生脈注射液和長(zhǎng)春新堿及聯(lián)合應(yīng)用此兩類藥物對(duì)接受藥物作用的人骨肉瘤細(xì)胞G292生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

G292細(xì)胞株；生脈注射液；長(zhǎng)春新堿；新生牛血清；1640培養(yǎng)基。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

配制血清濃度為12.5%的1640培養(yǎng)基，將G292細(xì)胞放置溫度37±1℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)，恢復(fù)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)分組

將細(xì)胞共分為A、B、C、三組，分別為空白組，應(yīng)用生脈注射液組（10、20、50、100μl/ml），應(yīng)用長(zhǎng)春新堿組（5、10、20、50μg/ml），生脈注射液聯(lián)合長(zhǎng)春新堿應(yīng)用組（生脈30μl/ml聯(lián)合長(zhǎng)春新堿5、10、20、50μg/ml）。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在加入藥品培養(yǎng)48小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量，初步判斷藥物及藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)G292細(xì)胞的影響。

1.5 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

指數(shù)生長(zhǎng)培養(yǎng)的G292細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的終濃度接種到96孔板，每孔200μl，細(xì)胞分別以不同濃度的生脈注射液培養(yǎng)48h后，向每個(gè)孔中加入20μL MTT（5mg/ml）。孵育4h后，吸棄培養(yǎng)基，紫色甲瓚晶體溶解于150μL/孔溫的DMSO中。使用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定570nm處的吸光度。細(xì)胞的存活率以對(duì)照孔的百分比表示。每次測(cè)定重復(fù)三次，以確?？煽啃浴?/p>

1.6 藥物敏感性檢測(cè)

指數(shù)生長(zhǎng)培養(yǎng)的G292細(xì)胞，以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的終濃度接種到96孔板，每孔200μl，細(xì)胞分別以不同濃度的長(zhǎng)春新堿（5、10、20、50μg/ml），生脈30μl/ml聯(lián)合長(zhǎng)春新堿5、10、20、50μg/ml用藥處理，培養(yǎng)48h后后續(xù)操作同1.5，并計(jì)算增敏倍數(shù)?；熢雒舯稊?shù)=單用化療藥物IC50/聯(lián)合用藥時(shí)化療藥物IC50。聯(lián)合治療效果常采用金正均Q值法評(píng)價(jià)：Q=EA+B/（EA+EB-EA·EB）。EA代表A藥單獨(dú)給藥時(shí)的抑制率，EB代表B藥單獨(dú)給藥時(shí)的抑制率，EA+B代表A、B兩藥合并給藥后的抑制率，0.85≤Q≤1.15為相加作用，Q>1.15為協(xié)同作用，Q<0.85為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

分別加入對(duì)應(yīng)藥品培養(yǎng)48小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)如圖1。

由圖1可見，生脈注射液30μl/ml組的細(xì)胞間距增加，長(zhǎng)春新堿10μg/ml組細(xì)胞數(shù)量減少，濃度增加到50μg/ml后，細(xì)胞形態(tài)異常，生長(zhǎng)狀態(tài)不良。與生脈注射液聯(lián)合用藥后，長(zhǎng)春新堿10μg/ml組細(xì)胞形態(tài)改變顯著，細(xì)胞邊界模糊，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒，長(zhǎng)春新堿50μg/ml組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)極差，細(xì)胞數(shù)量急劇減少，出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞，成明顯抑制。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

生脈注射液能有效抑制G292細(xì)胞的增殖，如圖2所示， 10、20、50、100μl/ml體積分?jǐn)?shù)的生脈注射液作用于G292細(xì)胞48h的生長(zhǎng)抑制率為15.85%、27.02%、47.53%、63.38%、且其抑制作用呈濃度依賴性。IC50濃度為65.65μl/ml。

2.3 生脈注射液聯(lián)合長(zhǎng)春新堿對(duì)G292細(xì)胞藥物敏感性的影響

選用體積分?jǐn)?shù)為30μl/ml的生脈注射液與不同濃度的長(zhǎng)春新堿聯(lián)合使用，觀察生脈注射液對(duì)長(zhǎng)春新堿抗腫瘤增殖的相加作用，如圖3所示，IC50濃度為39.14μg/ml，體積分?jǐn)?shù)為30μl/ml的生脈注射液與不同濃度的長(zhǎng)春新堿（5、10、20、50μg/ml）聯(lián)用Q值分別為0.86、0.97、1.02、0.91。表現(xiàn)為相加作用，IC50濃度為3.04μg/ml，增敏倍數(shù)為12.875。

3 討論

人骨肉瘤發(fā)病率在原發(fā)性惡性腫瘤中占據(jù)首位，該瘤惡性程度甚高，愈后極差且腫瘤細(xì)胞原發(fā)或繼發(fā)的耐藥問題[3]，可于數(shù)月內(nèi)出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，截肢后3～5年存活率僅為5～20%。通過研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)春新堿是作用于細(xì)胞周期的一種特異性藥物，一般在S期通過與微觀蛋白結(jié)合，阻斷細(xì)胞周期來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[4-5]。生脈注射液主要成分為中藥紅參、麥冬、五味子等，最新研究發(fā)現(xiàn)生脈注射液也具有一定的抗腫瘤作用且可以加強(qiáng)化療療效、減輕化療藥物的毒副作用、提高患者生存質(zhì)量。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，生脈注射液或長(zhǎng)春新堿單藥均有抑制G292細(xì)胞增殖的作用，藥敏分析表明，聯(lián)合用藥效果為相加作用。以本研究結(jié)果作為依據(jù)，可為臨床腫瘤治療提供更多治療方案，以此減低腫瘤患者化療副作用，提高生存質(zhì)量，但藥物聯(lián)合作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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