馬澤剛 黃春花 鐘輝云 吳秀麗 周禮仕 劉卓

摘要：建立絞股藍[Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino]總皂苷的最佳提取工藝條件，并比較不同產(chǎn)地絞股藍中的總皂苷含量以及抗氧化活性差異。結(jié)果表明，絞股藍總皂苷最佳提取工藝為60 ℃條件下，60%乙醇回流提取4次，提取時間2 h，料液比為1∶10。不同產(chǎn)地絞股藍總皂苷含量為江西>廣東>云南>陜西>內(nèi)蒙古>福建>四川>湖北。DPPH自由基清除率結(jié)果表明，不同產(chǎn)地絞股藍抗氧化能力為陜西>湖北>江西>內(nèi)蒙古>廣東>福建>云南>四川。建立的絞股藍中總皂苷含量提取工藝簡便、穩(wěn)定、可行，不同產(chǎn)地絞股藍中總皂苷含量和抗氧化活性存在差異，該結(jié)果可為今后絞股藍的開發(fā)利用和深入研究提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：絞股藍[Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino]；總皂苷；抗氧化；提取工藝

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）14-0109-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.026 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： To establish optimal extraction technology for the total saponins in Gynostemma pentaphyllum，and prepare the difference of content from different producing areas，and the difference of antioxidant activity. Results showed that the optimal extraction technology was as follow：under 60 ℃，Gynostemma pentaphyllum powder was by reflux extraction in 60% ethanol for 4 times with each time for 2 h. The ratio of sample to extraction solution 1∶10. Total saponin content of Gynostemma pentaphyllum from different producing areas was difference. The highest was Jiangxi，and the lowest was Hubei. The results of DPPH scavenging rate showed that the antioxidant activity of Gynostemma pentaphyllum from different producing areas was difference. The highest was Shaanxi，and the lowest was Sichuan. The results showed that the extraction process was simply，stable and feasible. There was a significant difference in the content of total saponin and antioxidant activity in Gynostemma pentaphyllum from the different areas. It provided certain reference significance for development and further study of the resources in Gynostemma pentaphyllum.

Key words： Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino； total saponin； antioxidant； extraction technology

絞股藍[Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino]系葫蘆科（Cucurbitaceae）絞股藍屬（Gynostemma）多年生草質(zhì)藤本植物[1]。《中藥大辭典》名七葉膽，別名小苦藥、遍地生根、五葉參，日本名甘茶蔓等[2-4]。該屬植物基源復雜、品種繁多，中國有14種和3變種[5]，廣泛分布于陜西、四川、湖北、福建、云南等地。絞股藍中含有皂苷、多糖、黃酮類等化合物及鐵、鋅、銅、錳、硒等20多種微量元素[6-9]。其中皂苷是絞股藍的藥效成分[10，11]，其藥用效果與人參皂苷相似[12]，國內(nèi)外研究證明絞股藍皂苷具有明顯的抗腫瘤、降血脂、抗疲勞、保肝等作用[13]。本研究以絞股藍總皂苷得率為指標，采用單因素試驗比較不同提取因素對絞股藍總皂苷提取的影響，并進行正交試驗設(shè)計優(yōu)化，進而比較8個不同產(chǎn)地絞股藍總皂苷的含量，并對其抗氧化活性進行了測定，以期為絞股藍的開發(fā)利用和深入研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8種不同產(chǎn)地的絞股藍購自于成都市藥材市場，經(jīng)四川衛(wèi)生康復職業(yè)學院副主任藥師鐘輝云鑒定為葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍[Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino]；水為去離子水，甲醇、乙醇、正丁醇、高氯酸、香草醛等其他試劑均為分析純。

7200型可見分光光度計（尤尼科儀器有限公司）；KQ5200B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 總皂苷測定法

1）對照品溶液的制備。精密稱定人參皂苷Rb1 3 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇至定容，作為對照品液，備用。

2）供試品溶液的制備。在60 ℃條件下，取烘干的藥材粗粉1 g，以10倍藥材量60%乙醇提取4次，每次2 h，蒸干后用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。

3）線性關(guān)系考察。吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分別置于10 mL具塞試管中，60 ℃將溶劑揮發(fā)干，分別加入5%香草醛冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，混勻，密塞，置60 ℃水浴中保溫15 min，取出，冷卻，加冰醋酸5 mL，混勻，以空白試劑為對照，在550 nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程：y=3.412x+0.011 2，R2=0.999 5，線性范圍0～50 μg/mL。

4）精密度試驗。吸取制備供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，在同一條件下連續(xù)測得6次吸光度，RSD為1.02%。

5）穩(wěn)定性試驗。吸取制備供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，分別在0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h測得吸光度，RSD為1.09%。

6）重復性試驗。取同一批藥材6份，制備供試品溶液，吸取各供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，計算其含量，RSD為1.21%。

1.2.2 單因素對總皂苷提取的影響

1）提取方式對絞股藍總皂苷提取的影響。①加熱提取法。取烘干的江西絞股藍藥材粉碎，過60目篩得粗粉，取1 g（下同），在70 ℃條件下，用20 mL乙醇提取1 h，過濾。濾液蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，得出總皂苷含量，計算得率。②冷浸法。在25 ℃條件下，取烘干的藥材粉碎，過60目篩得粗粉，取1 g，用10倍于干粉體積的乙醇冷浸24 h，蒸干。用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，得出總皂苷含量，計算得率。③超聲提取法。在25 ℃條件下，取烘干的藥材粉碎，過60目篩得粗粉，取1 g，用10倍于干粉體積的乙醇浸泡，于超聲振蕩器中振蕩提取60 min，蒸干。用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，得出總皂苷含量，計算得率。

2）提取溶劑對絞股藍總皂苷提取的影響。在70 ℃條件下，取烘干的藥材粉碎，過60目篩得粗粉，取1 g，分別置于10倍藥材量的水、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇加熱1.5 h。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，得出總皂苷含量，計算得率。

3）提取溫度對絞股藍總皂苷提取的影響。取烘干的藥材粉碎，過60目篩得粗粉，取1 g，以10倍藥材量的60%乙醇提取1.5 h。提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，得出總皂苷含量，計算得率。

4）提取時間對絞股藍總皂苷提取的影響。在60 ℃條件下，取烘干的藥材粉碎，過60目篩得粗粉，取1 g，以10倍藥材量的60%乙醇提取，提取時間分別為1.0、1.5、2.0、3.0 h。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，得出總皂苷含量，計算得率。

5）提取料液比對絞股藍總皂苷提取的影響。在60 ℃條件下，取烘干的藥材粉碎，過60目篩得粗粉，取1 g，分別以5、10、20、30倍藥材量的60%乙醇提取2 h。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，得出總皂苷含量，計算得率。

6）提取次數(shù)對絞股藍總皂苷提取的影響。在60 ℃條件下，取烘干的藥材粉碎，過60目篩得粗粉，取1 g，以10倍藥材量的60%乙醇提取1、2、3、4、5次，每次2 h。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，得出總皂苷含量，計算得率。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取提取溫度（A）、提取時間（B）、提取溶劑（C）為考察因素，以總皂苷得率為指標，正交試驗因素與水平見表1。

1.2.4 不同產(chǎn)地絞股藍總皂苷含量測定 在60 ℃條件下，取不同產(chǎn)地烘干的絞股藍藥材粗粉1 g，以10倍藥材量的60%乙醇提取4次，每次2 h，蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供試品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞試管中，測定吸光度，得出總皂苷含量，計算其得率。

1.2.5 不同產(chǎn)地絞股藍總皂苷抗氧化活性測定 DPPH自由基（1，1-二苯基-2-苦味?；杂苫┣宄芰y定方法。將待測物用甲醇溶解，配制成一定濃度后梯度稀釋。DPPH自由基濃度0.16 mmol/L。在試管中分別加入2 mL待測液和2 mL的DPPH自由基溶液，充分振搖后置于暗處在室溫下反應(yīng)30 min，然后測定波長517 nm處的吸光度。2 mL待測液加入等體積甲醇作為樣品對照，2 mL的DPPH自由基溶液加入等體積甲醇作為空白，測定時用純甲醇調(diào)零，重復3次，取平均值。參照下述公式計算樣品的DPPH自由基清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取方法對絞股藍總皂苷提取的影響 不同提取方法對絞股藍總皂苷得率的影響見表2，各種提取法總皂苷得率大小順序為加熱提取法>超聲提取法>冷浸法。試驗?zāi)康脑谟诒容^提取方法，故未考慮溫度的影響，選用加熱提取法作為總皂苷的提取方法。

2.1.2 提取溶劑對絞股藍總皂苷提取的影響 提取溶劑對絞股藍總皂苷得率的影響見圖1，隨著提取溶劑乙醇濃度升高，總皂苷得率升高，當乙醇濃度達60%時達到最大，然后下降。可見，提取溶劑乙醇濃度達60%時，對總皂苷提取效果好，總皂苷最佳提取溶劑為60%乙醇。

2.1.3 提取溫度對絞股藍總皂苷提取的影響 提取溫度對絞股藍總皂苷得率的影響見圖2，隨著提取溶劑溫度升高，總皂苷得率升高，當溫度達60 ℃時達到最大，然后下降?？梢?，當溫度達60 ℃時，對總皂苷提取效果好，故總皂苷的最佳提取溫度為60 ℃。

2.1.4 提取時間對絞股藍總皂苷提取的影響 提取時間對絞股藍總皂苷得率的影響見圖3。隨著提取時間增加，提取效果會更好。但提取時間大于2 h總皂苷得率增加不明顯，提取時間為2 h比較合適。

2.1.5 料液比對絞股藍總皂苷提取的影響 料液比對絞股藍總皂苷得率的影響見圖4，隨著料液比增加，總皂苷得率增加。當達到1∶10后趨于穩(wěn)定見，最佳提取料液比為1∶10。

2.1.6 提取次數(shù)對絞股藍總皂苷提取的影響 提取次數(shù)對絞股藍總皂苷得率的影響見圖5，隨著提取次數(shù)增加，總皂苷得率增多。但4次以后變化不大，最佳提取次數(shù)為4次。

2.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表3，以總皂苷得率為考察指標，影響因素的主次順序提取時間（B）>提取溫度（A）>提取溶劑（C），絞股藍總皂苷提取最佳工藝為A2B2C2。即60 ℃條件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比為1∶10。

2.3 工藝驗證結(jié)果

按正交試驗結(jié)果確定的最佳工藝方案，即60 ℃條件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比為1∶10。重復提取烘干的藥材粗粉3次，RSD為1.40%，3次差異較小，該工藝穩(wěn)定、可行。

2.4 不同產(chǎn)地絞股藍總皂苷含量結(jié)果

不同產(chǎn)地絞股藍總皂苷的含量結(jié)果見表4。不同產(chǎn)地絞股藍總皂苷含量為江西>廣東>云南>陜西>內(nèi)蒙古>福建>四川>湖北。

2.5 不同產(chǎn)地絞股藍總皂苷抗氧化活性結(jié)果

以皂苷濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，計算自由基清除率，結(jié)果見圖6。不同產(chǎn)地絞股藍氧化能力陜西>湖北>江西>內(nèi)蒙古>廣東>福建>云南>四川，這可能是由于生長環(huán)境的不同造成的。

3 結(jié)論

通過對絞股藍總皂苷提取工藝的單因素試驗和正交試驗分析，確定了絞股藍總皂苷最佳提取工藝為60 ℃條件下，60%乙醇回流提取4次，提取時間為2 h，料液比為1∶10。不同產(chǎn)地絞股藍總皂苷含量為江西>廣東>云南>陜西>內(nèi)蒙古>福建>四川>湖北。DPPH自由基清除率結(jié)果表明，不同產(chǎn)地絞股藍抗氧化能力為陜西>湖北>江西>內(nèi)蒙古>廣東>福建>云南>四川。皂苷是絞股藍發(fā)揮其藥理活性的主要化學成分，選擇總皂苷含量高、抗氧化活性好的絞股藍品種可直接提高絞股藍的經(jīng)濟價值。不同產(chǎn)地的絞股藍總皂苷含量和抗氧化活性存在一定的差異，可能是由于生長環(huán)境的不同造成的。

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