任爍淇 劉冰洋 李雪瑩 邢建輝 李政綸 王 楚 冮慧欣 劉桂豐 姜 靜

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗室，哈爾濱 150040)

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)是我國重要工業(yè)用材樹種和山地造林樹種，自20世紀(jì)90年代白樺被列為科技攻關(guān)樹種以來，作者所在研究團(tuán)隊先后開展了雜交育種、強(qiáng)化育種、倍性育種等研究[1～5]，尤其在基因工程育種方面取得了一定的成效，自2003年以來相繼進(jìn)行了白樺耐鹽、縮短童期、改變木質(zhì)素含量等轉(zhuǎn)基因研究[6～9]，迄今為止，獲得了130余個獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系，其中在獲得的18個BpCCR1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因白樺中，發(fā)現(xiàn)了一株轉(zhuǎn)基因白樺葉片顏色明顯不同其他轉(zhuǎn)BpCCR1白樺，該轉(zhuǎn)基因株系除了葉色黃化性狀與其他轉(zhuǎn)基因株系有差異外(包括非轉(zhuǎn)基因野生型白樺)，其它表型性狀均無差異，我們認(rèn)為該株系是由于T-DNA插入(含外源基因)而產(chǎn)生的突變體[9]。

葉色突變是植物中最常見的突變性狀，迄今為止已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小麥(Triticumaestivum)、棉花(AnemonevitifoliaBuch)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)等多種植物中發(fā)現(xiàn)了不同類型的葉色突變體[10～16]。葉色變異不僅可以作為標(biāo)記性狀應(yīng)用于水稻等作物的雜交制種，在基礎(chǔ)研究中，葉色突變體是研究植物光合作用機(jī)制、葉綠素生物合成分解途徑、遺傳表達(dá)機(jī)理、質(zhì)—核基因互作以及信號傳導(dǎo)途徑等一系列生理代謝過程的理想材料[17～21]，因此，葉色突變體備受育種工作者的關(guān)注。實(shí)驗以黃葉突變株為試驗材料，測定葉綠素與葉色的時序變化規(guī)律，分析其生長特性，研究結(jié)果為后續(xù)開展突變基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

3年生的轉(zhuǎn)BpCCR1基因白樺黃葉突變體(yl)、轉(zhuǎn)基因株系(CR11)及非轉(zhuǎn)基因野生型白樺(WT)，每個株系30株，種植于30 cm×20 cm花盆中，置于白樺育種基地進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2 方法

1.2.1 葉片顏色的時序變化

(1)RHS比色：將葉片近軸面與RHS標(biāo)準(zhǔn)比色卡(英國皇家園藝學(xué)會)進(jìn)行對比，記錄葉片的顏色。

(2)色差儀比色：采用分光色差儀(KONICA MINOLTA CR-400)測定參試株系葉片的中部，每個株系測定30個不同單株，每株1個葉片，取其平均值。測定于5月1日開始，9月11日結(jié)束，每10 d測定1次。測量結(jié)果用CIELab表色系統(tǒng)進(jìn)行色度分析，其中，L*代表黑色到白的間的位置，既明亮度(Lumination)，范圍是0～100；a*代表紅(+a)綠(-a)色軸飽和度；b*代表黃(+b)藍(lán)(-b)色軸飽和度(圖1)。

圖1 CIELab表色系統(tǒng)色品圖Fig.1 Chromaticity diagram of CIELab color numeration system

1.2.2 葉片葉綠素含量的測定

采用便攜式葉綠素測定儀(SPAD-502 PLUS，KONICA MINOLTA)測定yl、CR11及WT株系功能葉的葉綠素相對含量，讀取SPAD值，測定于5月1日開始，9月11日結(jié)束，每10 d測定1次，每次每個株系測定10株樹葉片，3次重復(fù)，共計測定30個株系，每株樹均測定健康的第4葉片。

1.2.3 生長性狀調(diào)查

于5月3日開始，10月1日結(jié)束，每10 d調(diào)查1次，共調(diào)查14次(以1月1日為第1天，5月3日為第123天，以此類推，最后調(diào)查的時間10月1日為第273天)。用米尺測量參試株系苗高，待苗木停止生長后，用游標(biāo)卡尺測量地徑，yl、CR11及WT株系分別調(diào)查30株。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)利用MATLAB Compiler Runtime 8.3對苗高的生長規(guī)律進(jìn)行Logistic方程擬合，Logistic曲線方程：

(1)

式中：y為苗木苗高(cm)；t為苗木生長的時間，1月1日為1 d；a為苗木開始生長時的苗高初始值(cm)；b為苗木停止生長時苗高值(cm)；t0為苗木苗高日生長速度最快的日期(d)；c為曲線在苗木苗高日生長速度最快處的斜率(cm·d-1)。

苗木苗高年生長階段的劃分可通過對式(1)求三階導(dǎo)數(shù)，結(jié)果為：

(2)

用t1和t2表示速生期的開始期和速生期結(jié)束期，利用t1和t2將苗高的年生長過程分為三個階段：(0，t1)、(t1，t2)、(t2，封頂)。第一階段為“前慢期”，處于該階段的苗木生長逐漸加快；第二階段為“速生期”，處于該階段的苗木持續(xù)快速生長；第三階段為“后慢期”，處于該階段的苗木生長逐漸減慢，直至封頂。在符合“S”型曲線的林木個體生長過程中，速生期是林木生長的關(guān)鍵階段[22～23]，通過擬合方程得出幾個速生期參數(shù)。

(1)速生期的起始點(diǎn)t1；

(2)速生期的結(jié)束點(diǎn)t2；

(3)速生點(diǎn)t0；

(4)速生期的持續(xù)時間RR=t2-t1；

(5)速生期苗高的平均生長量GR=t2點(diǎn)的苗高-t1點(diǎn)的苗高；

(6)速生期內(nèi)苗高日生長量的平均值GD=GR·RR-1；

(7)速生期內(nèi)生長量占總生長量的比值RRA=GR·(b-a)-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃葉突變株葉色時序變化規(guī)律

RHS比色卡測定結(jié)果顯示，yl突變株的葉色一直呈現(xiàn)深黃綠色，CR11(轉(zhuǎn)基因?qū)φ?株系的葉色在6月初為深黃綠色，隨后漸漸的變?yōu)闇\橄欖綠或暗橄欖綠，而WT(野生型)株系從6月上旬開始葉色由原來的淺橄欖綠漸漸的變?yōu)榘甸蠙炀G?？傊瑓⒃囍晗档纳L發(fā)育階段，yl的葉色主要呈現(xiàn)深黃綠色，而兩個對照株系的葉色是以橄欖綠色為主(圖2)。

色度計測定結(jié)果顯示，在生長季的不同發(fā)育時期，參試株系葉片的a*值均小于0，而b*值均大于0，葉片顏色均分布于表色系統(tǒng)色品圖的第二象限黃綠色區(qū)域(圖1),黃葉突變株的L*值為48.17～56.77；a*值為-20.04～-15.02；b*值為23.1～44.3，而對照株系的L*值為29.65～43.89；a*值為-15.97～-6.64，b*值為7.06～23.68(圖3)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黃葉突變株的L*值和b*值均顯著高于2個對照株系，a*值顯著低于2個對照株系(P≤0.05)。表明黃葉突變株的葉色在不同發(fā)育時期其亮度及黃色程度均高于2個對照株系，從黃葉突變株葉色參數(shù)b*值也可以看出其葉色更趨向于CIELab系統(tǒng)色拼圖的黃色區(qū)域。

圖2 不同發(fā)育期參試株系葉片顏色觀察 a～c.6月5日的葉色；d～f.7月5日的葉色；g～i.8月5日的葉色；j～l.9月5日的葉色 a.WT(146 Moderate Olive Green A)；b.CR11轉(zhuǎn)基因株系(144 Strong Yellow Green A)；c.黃葉突變株(N144 Strong Yellow Green A)；d.WT(NN137 Greyish Olive Green D)；e.CR11(137 Moderate Olive Green B)；f.黃葉突變株(144 Strong Yellow Green A)；g.WT(NN137 Greyish Olive Green A)；h.CR11(139 Dark Yellowish Green A)；i.黃葉突變株(144 Strong Yellow Green A)；j.WT(NN137 Greyish Olive Green A)；k.CR11(139 Dark Yellowish Green A)；l.黃葉突變株(144 Strong Yellow Green A)Fig.2 Leaf color observation in different development periods of the test lines a-c. The leaf color on June 5；d-f. The leaf color on July 5；g-i. The leaf color on August 5；j-l. The leaf color on September 5

2.2 黃葉突變株葉綠素含量的時序變化

由圖4可見，從早春到9月中旬，2個對照株系各發(fā)育時期其葉綠素SPAD值均顯著高于黃葉突變株(P<0.05)，2個對照株系SPAD均值為39.15，而yl突變株系的SPAD值為18.84，僅是2個對照株系的48.12%。

圖3 參試株系葉片L*值、b*值、a*值時序變化 a、b、c為同一時間點(diǎn)3個參試株系L*值、b*值、a*值的多重比較Fig.3 Temporary variation of test lines about value a,value b and value L a,b and c in figures indicate the multiple comparisons between test lines about value a,value b and value L in the same time

圖4 參試株系葉綠素含量相對含量時序變化 a、b、c為同一時間點(diǎn)3個參試株系SPAD值的多重比較Fig.4 Temporary variation of the test lines about relative chlorophyll content a,b and c in figures indicate the multiple comparisons between test lines about SPAD value in the same time

2.3 黃葉突變株生長特性分析

2.3.1 參試株系苗高生長模型的建立與擬合

分別對參試株系苗高生長過程進(jìn)行擬合(圖5)，3個株系苗高生長過程為“S”型曲線，用4參數(shù)Logistic方程式(1)對3個株系共90個單株苗高進(jìn)行擬合取平均值，方程中各參數(shù)見表1，各生長模型方程的擬合系數(shù)均高于0.95，達(dá)到顯著水平，說明用4參數(shù)Logistic曲線方程對參試株系生長節(jié)律進(jìn)行擬合是準(zhǔn)確可靠的，可用于參試株系高生長分析與預(yù)測。

由表1可知，yl突變株與2個對照株系的苗高生長(即停止生長后的實(shí)測值)差異顯著(P<0.05)，yl苗高顯著低于2個對照株系，yl苗高均值僅為2個對照株系均值的35.15%，其苗高速生點(diǎn)處的生長速度為0.755 cm·d-1，顯著低于2個對照株系，僅為2個對照均值的50.9%。

2.3.2 黃葉突變株速生期生長參數(shù)變異

參試株系苗高從5月初開始生長，9月中下旬封頂，生長期約為140 d。由表2可知，yl突變株與2個對照株系從開始生長、到進(jìn)入速生期以及速生期結(jié)束的時間基本一致，不同的是yl在速生期內(nèi)苗高的平均生長量(GR)為38.61 cm，顯著低于2個對照株系，其速生期內(nèi)苗高日生長量均值(GD)也顯著低于2個對照株系，僅為2個株系均值的58.50%，yl與2個對照株系的速生期內(nèi)生長量占總生長量的比值RRA無明顯差異。

3 討論

植物隨季節(jié)的變化往往葉片顏色也伴隨著的變化，特別是春秋兩個季節(jié)葉色的變化更明顯。野生型白樺葉片春季開始萌葉，即葉片在生長初期，其葉綠素含量較少，其葉綠素SPAD值僅為32.41，到了8月以后，SPAD值達(dá)到48.61，即由淺橄欖綠逐漸變?yōu)榘甸蠙炀G，只有在落葉前葉片呈現(xiàn)黃色。而黃葉突變株葉片顏色明顯不同野生型白樺，在其生長發(fā)育期內(nèi)葉綠素SPAD值一直顯著低野生型白樺，從早春到深秋葉片始終為深黃綠色。植物葉色變異也往往與葉綠體中色素含量的變化有關(guān)[22～24]。在多數(shù)黃化突變體中,其葉綠素的含量顯著低于野生型[25～26]，白樺黃葉突變株與前人研究結(jié)果類似，即葉色在各發(fā)育時期其葉綠素SPAD值均顯著低于對照株系(P<0.05)，yl突變株系的SPAD值為18.84，僅為2個對照株系的48.12%。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量多少不僅影響葉片顏色，同時也影響植物生長與產(chǎn)量等[27]。對水稻低葉綠素含量突變體研究發(fā)現(xiàn)，該突變體雖然葉綠素含量降低，但葉綠體的發(fā)育并未受到影響，高光強(qiáng)下其并未受到光抑制，光反應(yīng)電子傳遞也未受影響。產(chǎn)量數(shù)據(jù)表明，黃葉突變體的產(chǎn)量與對照無顯著差別[27]。而本實(shí)驗的黃葉樺突變株則與前人研究結(jié)果不同，葉綠素SPAD值較對照株系顯著降低，其苗高生長也顯著低于2個對照株系，即速生期內(nèi)苗高均值僅是2個對照株系均值的69%。推測yl突變體苗高生長低于對照株系可能是葉綠體發(fā)育異常，以及葉綠素含量的降低所致。人們在對白榆(Ulmuspumila)的天然黃葉突變體中華金葉榆的研究中也發(fā)現(xiàn)，其苗高生長緩慢，葉綠素含量及凈光合速率顯著低于綠葉白榆[28]。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場所，諸多研究表明由葉綠素合成缺陷而產(chǎn)生的突變體，其葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)也將發(fā)生一定的變化[29]，葉綠素的合成是一個由許多酶參與的復(fù)雜過程，從谷氨酰-tRNA(Glu-tRNA)開始到葉綠素b的合成結(jié)束為止一共包括16步，涉及20多個基因編碼的16種酶參與完成，該途徑中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生突變都可能影響葉綠素的合成，從而引起葉色變異[30]。因此，葉色突變的分子機(jī)制較為復(fù)雜，引起葉色突變的基因種類也繁多，yl突變體是研究團(tuán)隊獲得的白樺T-DNA插入突變體，目前突變基因的克隆正在進(jìn)行中，一旦獲得引起突變性狀的基因并驗證其功能，將可解釋yl突變體類囊體發(fā)育異常和葉綠素合成缺陷等現(xiàn)象，也將為園林綠化彩葉樹基因工程育種提供基因資源。

圖5 參試株系樹高邏輯斯蒂擬合曲線Fig.5 Logistic fitting curve of the test lines about height

株系Lines封頂后苗高實(shí)測值Measure values of height when test lines stop growing(cm)R2苗木開始生長時苗高值aValues of height when test lines start growing(cm)苗木停止生長時苗高值bValues of height when test lines stop growing(cm)速生點(diǎn)t0Fast-growing point(d)苗高速生點(diǎn)處生長速度The growing speed on fast-growing point(cm·d-1)WT(對照1)Control group 1244.7(a)0.9898155.4375(a)244.7(a)190(a)1.484(a)CR11(對照2)Control group 2207.1(b)0.9884120.6(b)207.1(b)200(b)1.481(a)yl146.5(c)0.959997.2(c)146.5(c)194(ab)0.755(b)

表2 參試株系速生期生長參數(shù)比較