• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      表皮生長因子對(duì)結(jié)腸細(xì)胞中緊密連接蛋白表達(dá)和磷酸化的影響

      2018-11-07 05:38:00黃媛媛李忠穩(wěn)夏先明
      關(guān)鍵詞:屏障亞型磷酸化

      黃媛媛,李 靜,李忠穩(wěn),夏先明

      潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC) 是一種腸道疾病,病理特征是炎癥反應(yīng)和黏膜損害。過度的炎癥反應(yīng)破壞了腸上皮細(xì)胞層的完整性,導(dǎo)致黏膜潰瘍[1]。TJs蛋白差異表達(dá)導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間結(jié)構(gòu)松散或形態(tài)變化是UC患者腸黏膜屏障功能降低的主要原因[2]。研究[3]證明,緊密連接(tight junctions,TJs)蛋白的磷酸化會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞的極性改變和結(jié)構(gòu)變化,從而影響上皮屏障功能。TJs蛋白的磷酸化狀態(tài)受酪氨酸激酶和絲氨酸-蘇氨酸激酶的調(diào)節(jié)。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是酪氨酸激酶家族中最重要的激酶,通過其配體表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)的激活,可以調(diào)節(jié)TJs蛋白的差異表達(dá)和磷酸化狀態(tài)[4]。該研究觀察T84結(jié)腸細(xì)胞中TJs蛋白的磷酸化狀況,以及EGF對(duì)TJs蛋白磷酸化的影響。

      1 材料與方法

      1.1實(shí)驗(yàn)材料T84結(jié)腸細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞中心;小鼠抗claudin-1抗體、小鼠抗claudin-5抗體、兔抗claudin-3抗體、兔抗claudin-7抗體、兔抗occludin抗體、兔抗Zo-1抗體、DMEM/F12培養(yǎng)基等購自美國Invitrogen公司;EGF購自美國Sigma公司;兔抗claudin-3(磷酸化位點(diǎn)Tyr219)抗體、兔抗claudin-5(磷酸化位點(diǎn)Tyr217)抗體、兔抗claudin-7(磷酸化位點(diǎn)Tyr210)抗體等購自美國Assay Biotechnology公司;兔抗β-tubulin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司;辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗購自上??党缮锕?;化學(xué)發(fā)光HRP底物購自美國Millipore公司。

      1.2細(xì)胞培養(yǎng)T84細(xì)胞傳至8~10代使用。以含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素,在37 ℃、5% CO2、90%相對(duì)濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。T84細(xì)胞培養(yǎng)至單層融合狀態(tài),然后在對(duì)照組培養(yǎng)基中加入DMSO (EGF溶劑,100 ng/ml),實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入EGF (100 ng/ml)。在干預(yù)后24、48、72 h進(jìn)行細(xì)胞遷移檢測或收集T84細(xì)胞,用于TJs蛋白的Western blot檢測。

      1.3Westernblot檢測從每個(gè)樣品中取出20 μg總蛋白,通過4%~20% SDS-PAGE電泳分離,并使用半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad)轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜在封閉溶液封閉2 h,加適當(dāng)比例稀釋的一抗孵育過夜??贵w稀釋濃度:小鼠抗claudin-1抗體、小鼠抗claudin-5抗體、兔抗claudin-3抗體、兔抗claudin-7抗體、兔抗occludin抗體、兔抗Zo-1抗體、兔抗claudin-3磷酸化抗體、兔抗claudin-5磷酸化抗體,以及兔抗claudin-7磷酸化抗體、兔抗β-tubulin抗體等均以1 ∶200比例來稀釋。以PBST洗滌PVDF膜4次。每次15 min,再加辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗,稀釋比例1︰1 000。最后將免疫復(fù)合物用辣根過氧化物酶底物的化學(xué)發(fā)光劑來顯影,拍照留存。

      1.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)使用劃痕的方法來評(píng)價(jià)EGF對(duì)細(xì)胞遷移的影響。T84細(xì)胞培養(yǎng)至單層融合狀態(tài),并在DMEM/F12(不含胎牛血清)培養(yǎng)基中過夜。用無菌的20 μl加樣槍頭在細(xì)胞中央劃痕,再用DMEM/F12洗去漂浮的細(xì)胞。劃痕后的對(duì)照組培養(yǎng)基中加入DMSO(100 ng/ml),實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入EGF(100 ng/ml)。分別于干預(yù)后24 h和48 h,在相同的位置用倒置顯微鏡(型號(hào)IX71,日本奧林巴斯公司)拍照,評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移的速度[5]。

      2 結(jié)果

      2.1EGF對(duì)T84細(xì)胞TJs蛋白的表達(dá)和磷酸化的影響與對(duì)照組比較,EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-3水平明顯下降(t=7.024,P<0.05),非磷酸化claudin-3水平升高(t=-6.874,P<0.05);EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在24 h和72 h后,非磷酸化claudin-3及磷酸化claudin-3與對(duì)照組比較均無明顯變化。見圖1。與對(duì)照組比較,EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-5水平升高(t=-13.115,P<0.05),非磷酸化claudin-5水平在72 h后明顯下降(t=5.356,P<0.05);EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在24 h后,非磷酸化claudin-5及磷酸化claudin-5與對(duì)照組比較均無明顯變化。見圖2。與對(duì)照組比較,EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-7水平升高(t=-7.116,P<0.05),非磷酸化claudin-7水平?jīng)]有變化;EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在24 h和72 h后,非磷酸化claudin-7及磷酸化claudin-7與對(duì)照組比較均無明顯變化。見圖3。與對(duì)照組比較,EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后非磷酸化claudin-1水平升高(t=-10.337,P<0.05);非磷酸化occludin水平在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均無變化;非磷酸化Zo-1水平在EGF干預(yù)24 h后高于對(duì)照組(t=-10.337,P<0.05),48 h后與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,72 h后有所下降(t=-10.987,P<0.05)。見圖4。

      2.2EGF對(duì)T84結(jié)腸細(xì)胞遷移的影響劃痕后24 h,EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞和對(duì)照組的遷移率分別為(37.48±3.82)%和(21.37±2.35)%,EGF干預(yù)組遷移率高于對(duì)照組(t=-8.831,P<0.05),這一趨勢在48 h后更為明顯,EGF干預(yù)組和對(duì)照組遷移率分別為(50.35±5.43)%和(23.83±2.63)%(t=-11.105,P<0.05)。見圖5。

      圖1 Western blot檢測EGF對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞中claudin-3蛋白磷酸化的影響

      圖2 Western blot 檢測EGF對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞中claudin-5蛋白磷酸化的影響

      圖3 Western blot 檢測EGF對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞中claudin-7蛋白磷酸化的影響

      圖4 Western blot 檢測EGF對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞中claudin-1、occludin、Zo-1蛋白表達(dá)的影響

      圖5 EGF 對(duì)T84 結(jié)腸細(xì)胞損傷/修復(fù)的影響 ×100

      3 討論

      TJs位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的頂層結(jié)構(gòu)中,形成一個(gè)生理性屏障來調(diào)節(jié)各種溶質(zhì)經(jīng)細(xì)胞旁的滲透。TJs蛋白包括claudin亞型、occludin和Zo亞型,是細(xì)胞主要的跨膜蛋白,相互之間形成連續(xù)的緊密連接束,并以組織特異性的方式相互作用,在上皮細(xì)胞間形成電荷和孔道選擇性屏障[6]。文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道,在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中,可出現(xiàn)claudin亞型、occludin和Zo亞型的表達(dá)下調(diào),并且這種效應(yīng)常伴有腸上皮層通透性的增加,以及上皮屏障功能的受損。研究[9]表明,蛋白的翻譯后修飾異常與疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,TJs蛋白的翻譯后修飾包括棕櫚化、O-糖基化和磷酸化。TJs蛋白的磷酸化是調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞層通透性的重要方法。

      某些TJs蛋白亞型適度的磷酸化是維持其生理功能所必須的;不過,TJs蛋白異常磷酸化會(huì)改變其彼此間的結(jié)合方式,從而影響TJs的聚集和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,使跨上皮細(xì)胞層電阻和上皮細(xì)胞間通透性發(fā)生變化,最終影響到上皮屏障的功能[10]。蛋白激酶C誘導(dǎo)的磷酸化使claudin-3參與裝配TJs的位點(diǎn)減少,導(dǎo)致TJs強(qiáng)度的下降[11]。claudin-5的酪氨酸磷酸化與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞層的通透性增加有關(guān),使單核細(xì)胞更容易通過損傷的血腦屏障[12]。在腎上皮細(xì)胞系,claudin-7磷酸化水平的升高與細(xì)胞間氯離子通透性增加有關(guān)[13]。TJs蛋白在UC時(shí)的磷酸化狀態(tài)至今未有文獻(xiàn)報(bào)道。

      Guntaka et al[14]發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)了膽管上皮細(xì)胞claudin-3的磷酸化,伴隨TJs結(jié)構(gòu)破壞和上皮屏障功能損傷,應(yīng)用EGF可以降低claudin-3水平磷酸化,修復(fù)膽管上皮屏障。本研究顯示,EGF影響了腸上皮細(xì)胞TJs蛋白的表達(dá)及磷酸化。與對(duì)照組比較,EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-3水平明顯下降,非磷酸化claudin-3水平升高,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。此外,EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后磷酸化claudin-5、claudin-7水平升高,72 h后非磷酸化claudin-5水平明顯下降,非磷酸化claudin-7水平?jīng)]有變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EGF 可以調(diào)節(jié)claudin亞型的磷酸化水平。文獻(xiàn)[15]報(bào)道中樞血管內(nèi)皮細(xì)胞中claudin-5、claudin-7的磷酸化與內(nèi)皮屏障功能受損有關(guān),而本試驗(yàn)未曾探討病理狀態(tài)下T84細(xì)胞中TJs蛋白的磷酸化狀況,僅提示EGF 可以調(diào)節(jié)提高claudin-5、claudin-7的磷酸化水平,其臨床意義有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

      本試驗(yàn)還觀察到,EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞在48 h后非磷酸化claudin-1水平升高,非磷酸化occludin水平在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均無變化,而非磷酸化Zo-1水平在EGF干預(yù)24 h后即升高,48 h后與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,72 h后有所下降。以上結(jié)果表明EGF可以調(diào)節(jié)TJs蛋白的表達(dá)。EGF還對(duì)細(xì)胞劃痕/修復(fù)有一定作用,表現(xiàn)為EGF干預(yù)過的T84細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組,提示EGF可能有助于腸黏膜損傷的修復(fù),與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。TJs蛋白的磷酸化使得其參與裝配TJs的位點(diǎn)減少[11],因而細(xì)胞間連接功能減弱,細(xì)胞遷移功能增強(qiáng);本研究顯示EGF改變了細(xì)胞claudin蛋白的磷酸化狀態(tài),同時(shí)促進(jìn)了上皮細(xì)胞的遷移,提示EGF介導(dǎo)的TJs蛋白磷酸化有助于上皮細(xì)胞的損傷后修復(fù)。

      綜上所述,EGF可以影響腸上皮細(xì)胞間TJs蛋白的表達(dá)和磷酸化狀態(tài),并促進(jìn)損傷上皮細(xì)胞的修復(fù)。EGF對(duì)UC的治療作用是否與此有關(guān),以及其具體機(jī)制,有待進(jìn)一步探討。

      猜你喜歡
      屏障亞型磷酸化
      咬緊百日攻堅(jiān) 筑牢安全屏障
      屏障修護(hù)TOP10
      一道屏障
      ITSN1蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
      維護(hù)網(wǎng)絡(luò)安全 筑牢網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)省屏障
      Ikaros的3種亞型對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響
      MAPK抑制因子對(duì)HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
      ABO亞型Bel06的分子生物學(xué)鑒定
      HeLa細(xì)胞中Zwint-1選擇剪接亞型v7的表達(dá)鑒定
      組蛋白磷酸化修飾與精子發(fā)生
      遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:01
      浦东新区| 南昌县| 潢川县| 金坛市| 诸暨市| 麻江县| 鹤岗市| 横峰县| 平邑县| 民乐县| 滦平县| 赤城县| 兴隆县| 文安县| 凌云县| 定边县| 荥经县| 泰宁县| 探索| 天峻县| 疏附县| 湘潭县| 兴化市| 汉阴县| 鄂托克前旗| 临沂市| 吉木萨尔县| 望城县| 大同市| 固镇县| 罗定市| 滨州市| 蛟河市| 通州市| 陇西县| 靖西县| 彰武县| 讷河市| 广东省| 南雄市| 凤庆县|