水稻秸稈高效降解菌株的篩選鑒定及其降解產物分析

尹 蕾， 王偉舵， 陳子璇， 賁愛玲， 吳雨龍， 黃 和

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京 211816； 2.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇南京 211171)

相關統計表明，全球每年約產出20億t的農作物秸稈，而我國產秸稈數量高達9億t，占全世界范圍內秸稈產量的20%～30%[1]。水稻秸稈主要是由纖維素、半纖維素、木質素、粗蛋白、低分子碳水化合物及無機鹽等構成的[2]。秸稈中含有多種化學微量元素，其中硅是含量最多的礦物元素[3]。水稻秸稈中纖維素和半纖維素含量相當，均在30%左右，兩者是維持水稻秸稈形態(tài)結構的主要物質，木質素含量較低，僅為4%，粗蛋白、結構蛋白含量分別為5%、4%，硅化物含量為9%[4]。細菌、真菌、放線菌主要負責分解秸稈中的纖維素與半纖維素，部分細菌和真菌也可用于分解木質素[5]?？梢越到饫w維素的真菌種類較多，分解能力較強的真菌主要分為木霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬。木質素可以被黃單胞菌、假單胞菌、不動桿菌等菌種分解，一般情況下真菌的分解能力比細菌強得多[6]。

本研究主要篩選高效降解秸稈纖維素的微生物菌株。通過土壤微生物的富集與分離，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)單一碳源篩選，羧甲基纖維素(簡稱CMC)酶活性和濾紙酶活性的測定，篩選獲得高產纖維素菌株，并采用改進的Van Soest洗滌法測定供試菌株處理后水稻秸稈的失質量率與纖維素、半纖維素、木質素的含量[7]。從菌株對秸稈進行降解的培養(yǎng)基中提取有機物質，其中包括微生物分泌出的具有揮發(fā)性的有機化合物及其降解秸稈所產生的不同有機產物，探討枝孢菌BD-19的秸稈生物降解能力，為秸稈高效降解提供菌種資源和技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2015年9月至2016年9月在南京曉莊學院農產品質量與安全重點實驗室內進行。

1.1 材料與儀器

供試土樣：試驗土樣取自南京市江寧區(qū)稻麥輪作農田，共50份。

主要儀器有7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometer，簡稱GC-MS)，由美國Agilent公司提供。

主要供試藥品與試劑有：A，3，5-二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylic acid，簡稱DNS)試劑，稱量6.3 g DNS，加少量蒸餾水溶解后加入262 mL 2 mol/L NaOH溶液；B，稱取 185 mg 酒石酸鉀納，加500 mL蒸餾水加熱溶解?；旌螦、B后，加入5 g結晶苯酚和亞硫酸鈉，冷卻后，加入蒸餾水至 1 000 mL，用棕色磨砂廣口瓶儲存，保存1周后再使用。

0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH值= 4.5)：取271.2 mL溶液A，與228.8 mL溶液B混合，加入蒸餾水至 1 000 mL。

0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH值=5.0)：取205 mL溶液A、295 mL溶液B混勻后，向其中加入蒸餾水定容至 1 000 mL，即得。溶液A(0.1 mol/L檸檬酸)：21 g C6H8O7·H2O，加蒸餾水至1 000 mL。溶液B(0.1 mol/L檸檬酸鈉)：稱取29.4 g Na3C6H5O7·2H2O，加入蒸餾水定容至 1 000 mL。

0.51% CMC-Na溶液：稱取5.1 g CMC-Na，加入少量蒸餾水后加熱溶解，向其中加入5 mL pH值為5.0的檸檬酸緩沖液后混合均勻，并加蒸餾水定容至 1 000 mL。

中性洗滌劑。A：稱取18.6 g乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，簡稱EDTA)、6.8 g 硼酸鈉，加入少量蒸餾水后，適當加熱溶解。B：30 g十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)、10 mL乙二醇乙醚、4.56 g無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，加少量蒸餾水并加熱溶解。將A、B混勻后加蒸餾水定容至1 000 mL，調節(jié)pH值至7.0左右。

2.0 mol/L鹽酸溶液：量取800 mL 蒸餾水于1 L容量瓶中，加入密度為1.19 g/mL的濃鹽酸167 mL，加入蒸餾水定容至刻度。

72%硫酸溶液：取300 mL蒸餾水于1 L容量瓶中，緩慢加入密度為1.84 g/mL的濃硫酸665 mL，待冷卻至室溫后，加蒸餾水定容至刻度。

DNA提取液：將2.42 g Tris(三羥甲基氨基甲烷)、2.92 g NaCl、0.372 g EDTA-Na、1 g SDS溶于100 mL 去離子水中，將pH值調至8.0。

主要培養(yǎng)基有：(1)LB固體培養(yǎng)基。5 g酵母提取物、10 g 蛋白胨、5 g NaCl、15～20 g瓊脂，1 000 mL超純水，pH值為7.4。不添加瓊脂的為LB液體培養(yǎng)基。(2)PDA培養(yǎng)基。稱取200 g馬鈴薯切成小塊，煮沸20～30 min，加20 g蔗糖、16 g瓊脂粉，用純水定容至1 000 mL，pH值為7.4。不添加瓊脂粉的為PDA液體培養(yǎng)基。(3)羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基。0.5 g NH4NO3、0.5 g MgSO4·7H2O、1 g酵母提取物、15 g CMC-Na，用純水定容至1 000 mL。(4)赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)基。1.0 g KH2PO4、0.1 g NaCl、0.3 g MgSO4·7H2O、2.5 g NaNO3、0.01 g FeCl3、0.1 g CaCl2，用去離子水定容至 1 000 mL，pH值為7.2 。(5)秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)基。取1.0 g經NaOH溶液浸泡并水洗至中性的秸稈于三角瓶中，再加入100 mL赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)基。(6)秸稈粉末培養(yǎng)基。取經NaOH溶液浸泡并水洗至中性的秸稈于干燥箱，于80 ℃烘干至恒質量，粉碎過60目篩，于培養(yǎng)皿中加入5 g秸稈粉和 25 mL 混合溶液[0.5 g/L NaCl 、0.5 g/L MgSO4、3 g/L(NH4)2SO4、1 g/L KH2PO4、0.3 g/L CaCl2、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.015 g/L MnSO4·7H2O 、0.015 g/L ZnSO4·7H2O 、0.01 g/L CoCl2]，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 秸稈降解菌的初步篩選 稱取5.0 g稻麥輪作農田土樣，倒入含有45 mL無菌水的三角瓶中，在溫度為28 ℃的條件下搖床振蕩30 min后取出，為10-1濃度，用無菌水分別稀釋至10-5、10-6、10-7等3個濃度梯度用于涂布，分別涂布于LB培養(yǎng)基、PDA無菌平板，放置于溫度為28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2～3 d。將得到的單菌落進行分離純化。將上述分離得到的單菌落搖瓶發(fā)酵菌液接種至CMC-Na平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)2～3 d，觀察平板上水解圈并比較其大小，選取水解圈較大、較明顯的菌株。

1.2.2 纖維素酶活性測定

1.2.2.1 纖維素酶活性的測定 纖維素的酶活性主要由濾紙酶活性和內切酶活性表示。用DNS法測定還原糖含量，反應底物為非淀粉新華濾紙和羧甲基纖維素鈉(CMC鈉)，酶活性單位定義：1 mL酶溶液在溫度為50 ℃、pH值為4.8條件下，1 min水解底物生成1.0 μmoL葡萄糖的量為1個酶單位(U)。

1.2.2.2 濾紙酶活性(FPA)的測定 在5支試管中加入 0.5 mL 酶溶液和濃度為0.05 mol/L、pH值為4.5的檸檬酸緩沖液，并向對照試管中加入1.5 mL DNS，放在50 ℃水浴鍋中預熱5～10 min，各加入1.0 cm×6.0 cm無淀粉新華濾紙條，在溫度為50 ℃條件下保溫60 min，取出后立刻向非對照試管中加入1.5 mL DNS停止反應。在540 nm處記錄測定的其他各試管的D540 nm。根據葡萄糖標準曲線計算得出相應的葡萄糖含量，并計算出相應的濾紙酶活性。

1.2.2.3 內切酶活性的測定 在5支試管中加入0.5 mL粗酶液和1.0 mL 0.51% CMC-Na溶液，方法同濾紙酶活性測定。根據葡萄糖標準曲線得出相應的葡萄糖含量，并計算出其對應的內切酶活性。

1.2.3 秸稈液態(tài)發(fā)酵降解能力測定 將初步篩選出的菌株在PDA平板上培養(yǎng)，待其長滿平板時于超凈工作臺中用涂布器及無菌水沖洗出菌絲及孢子，將其全部轉入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為25 ℃、轉速為170 r/min條件下于搖床振蕩培養(yǎng)10 d后取出。秸稈失質量率的測定采用差質量法，通過改進的Van Soest方法測定樣品中的纖維素、半纖維素、木質素的降解率。

1.2.4 高效秸稈降解菌DNA的ITS(內轉錄間隔區(qū))鑒定 從篩選出的菌株中，選取酶活性及降解效果均較為突出的菌株進行鑒定。將菌株在PDA培養(yǎng)基上于溫度為25 ℃的條件下培養(yǎng)5 d，轉接到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7 d，收集子實體，提取DNA。以提取菌株的DNA為模板，分別以ITS1、ITS5為引物來PCR擴增ITS序列。PCR反應程序：94℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產物經過純化后送到南京鐘鼎生物技術有限公司進行測序。供試菌株的ITS測序拼接序列與NCBI(美國國立生物技術信息中心)中Blast數據進行比對，并利用MEGA4.1軟件構建發(fā)育進化樹。

1.2.5 菌株降解秸稈產物測定 先進行菌株接種，菌株接種3 d后可進行菌絲取樣，分別于接種3、5、10、20、30 d時取菌絲和培養(yǎng)基作為待分析樣品。衍生化反應后，每個樣品用于GC-MS分析后丟棄。利用AMDIS軟件(NIST，v2.69，Gaithersburg，MD，USA)和MSD Chemstation軟件(G1701 EAE.02.00.493，美國安捷倫科技有限公司)進行質譜峰的定性分析。將代謝物的質譜圖中質量碎片峰位置和信息與標準數據庫進行比對，從而對色譜圖中的各個峰數據進行分析。所用譜庫主要是NIST2005、Wiley。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

將來自稻麥輪作農田的土樣在LB和PDA固體培養(yǎng)基中進行分離與純化，共得到163株細菌，18株真菌。選用剛果紅染色法和CMC-Na水解圈測定試驗，根據得到的菌株菌落直徑(d，cm)和水解圈直徑(D，cm)，可得水解能力Dp，相關公式：Dp=(D/d)2，由此選出15株真菌。

2.2 纖維素酶活性的測定

纖維素的降解是多種酶體系共同作用的結果，本試驗主要測定供試菌株的CMC酶活性以及濾紙酶活性，作為菌株復篩的依據。通過液體發(fā)酵方式，篩選得到酶活性較高的12株真菌。將試驗真菌添加到PDA液體培養(yǎng)基中，在溫度為 25 ℃、轉速為150 r/min條件下搖床培養(yǎng) 72 h 后測定其酶活性，結果如表1所示。

2.3 秸稈液態(tài)發(fā)酵降解能力的測定

采用液態(tài)發(fā)酵的方式研究以上試驗得到的12株真菌。以改進的Van Soest洗滌法測定供試菌株對水稻秸稈中半纖維素、纖維素、木質素的降解效果。

在液態(tài)培養(yǎng)條件下，經各菌株處理，其中BD-19菌株處理后的降解效果與其他菌株相比明顯較好，其秸稈的失質量率達到44.51%，半纖維素、纖維素、木質素的降解率分別為16.64%、26.42%、11.43%(表2)。

2.4 高效秸稈降解菌的鑒定

如圖1所示，將真菌BD-19的ITS測序拼接序列與NCBI中Blast數據進行比對，BD-19與枝孢屬菌(Cladosporiumsp.)EU-375523的ITS序列同源性為99%[8]，結合供試菌株的菌落形態(tài)特征，可初步將其鑒定為Cladosporiumsp. BD-19。

表1 不同菌株的酶活性測定結果

注：數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下表同。

表2 秸稈降解后各組分含量變化

2.5 菌株降解秸稈產物的測定

將枝孢菌BD-19接種到秸稈粉末液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，分別于3、5、10、20、30 d采樣，進行降解秸稈所得產物的GC-MS測定，測定結果見圖2至圖6。

在降解過程中，檢測到有機化合物如烷、醇、酚、羧酸、硅氧烷、鹵代烴等。醇、酚、羧酸、硅氧烷等物質表明木質纖維素得到有效降解[9]。由表3可知，接種3 d獲得6種降解物，5 d后獲得13種降解物，10 d后獲得17種降解物，20 d后獲得5種產物，30 d后獲得3種產物?？煽闯鼍暝?0 d之前降解所得有機產物逐漸增多，在10 d之后降解所得產物明顯減少。其中，以接種10 d所得降解產物最多。

半纖維素是不同類型單糖構成的異質多聚體， 主要由包括木糖、阿拉伯糖、半乳糖等的五碳糖、六碳糖構成[10]。構成半纖維素的糖基主要有D-木糖基、D-甘露糖基、D-葡萄糖基、D-半乳糖基、L-阿拉伯糖基、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸基、D-半乳糖醛酸基、D-葡萄糖醛酸基等[11]。由表3可知，在接種3 d產物中有D-甘露酸；接種5 d產物中有葡萄糖醇；接種10 d產物中有D-果糖、半乳糖；接種20 d的產物中有葡萄糖酸；接種30 d產物中含有葡萄糖醇和葡萄糖酸。由此可知，本試驗所用的枝孢菌BD-19菌株對秸稈中的半纖維素中所含的糖基類物質有降解作用。

表3 枝孢菌BD-19在不同時間降解秸稈的代謝產物

半纖維素主要分為3類，即聚木糖類、聚葡萄甘露糖類、聚半乳糖葡萄甘露糖類，其中聚木糖類主要是以1，4-β-D- 吡喃型木糖構成主鏈，以4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸為支鏈的多糖，其主要由β-D-吡喃型木糖基、4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸基、α-L-呋喃型阿拉伯糖構成[12]。由表3可知，在菌株降解秸稈的5 d生成了D-戊二酸呋喃糖、阿拉伯吡喃糖，由此說明，枝孢菌BD-19對半纖維素中的聚木糖有降解作用。

構成半纖維素的3種糖類中的聚葡萄甘露糖是由D-吡喃型葡萄糖基、呋喃型甘露糖基以1，4-β型連接成主鏈[13]。另一類聚半乳糖葡萄糖甘露糖還有D-呋喃型半乳糖基用支鏈形式以1，6-α型連接到此主鏈上的若干D-呋喃型半乳糖基、D-吡喃型葡萄糖基上[14]，由表3可知，在菌株降解秸稈的3 d，產物中有D-甘露酸出現；在5 d時，產物中有葡萄糖醇出現；30 d時，產物中有葡萄糖醇、葡萄糖酸。由此可知，枝孢菌BD-19對半纖維素中的聚葡萄甘露糖具有一定的降解作用。

分析表3中物質結構可以看出，接種3 d時碳原子數在20個以上的物質有2種，5 d時有3種，10 d時有4種，20 d時沒有碳原子數在20個以上的物質，30 d時有1種。由此可見，碳鏈在10 d后有明顯的斷裂，初步推斷，枝孢菌BD-19在10 d左右對秸稈的降解作用較為明顯。

計算表3中物質的分子量可知，接種3 d時物質的分子量為 220～467；5 d物質的分子量為225～467；10 d時物質的分子量為153～461；20 d時物質的分子量為234～338；30 d時物質的分子量為231～338。由此可見，枝孢菌 BD-19在10 d后對秸稈的降解作用較明顯。

枝孢菌BD-19接種后5～7 d菌落生長最旺盛，之后菌落直徑不再擴大，在其生長期間，由于該菌細胞內纖維素酶、內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等沒有大量產生，所以在3～5 d 時枝孢菌BD-19可能對秸稈降解的速度較慢，因而所得產物較少；在5～10 d時推測，枝孢菌BD-19能產出較多的纖維素酶、內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等，從而提高了菌株對秸稈的降解速率。

在菌株生長的后期，隨著秸稈培養(yǎng)基中提供的糖類、碳源、氮源、無機鹽等菌株生長所必需的物質逐漸減少，影響了菌株的正常生長以及現有菌株的活性，從而導致3種纖維素、木質素降解酶的產生量越來越少。與本研究所顯示的結果一致，在菌株生長平穩(wěn)期過后的衰亡期，有機物含量越來越少。

3 結論與討論

本研究主要從稻麥輪作農田土樣中以稀釋涂平板的方法分離出各菌株，并進行純化。選用剛果紅染色法以及CMC-Na水解圈測定法，將所得菌株進行初次篩選后得到具有秸稈降解能力的15株真菌。測定這些菌株的CMC及FPA酶活性后，進一步得到酶活性較高的12株真菌。

在液態(tài)發(fā)酵條件下，將秸稈作為唯一碳源的培養(yǎng)基于搖床振蕩培養(yǎng)10 d后，秸稈的形態(tài)明顯發(fā)生了變化，以差質量法測定其失質量率與半纖維素、纖維素、木質素的降解率。其中，真菌BD-19降解秸稈的失質量率達到44.51%，半纖維素、纖維素、木質素的降解率分別為16.64%、26.42%、11.43%。BD-19菌株經過形態(tài)特征及ITS的系統發(fā)育分析，鑒定其屬于枝孢菌屬。

利用GC-MS對篩選出的高效降解秸稈菌株BD-19降解秸稈的能力進行進一步研究。通過對其降解秸稈產生有機物的分析表明，產物中除了含有少量烷烴類物質外，還含有32種有機物，從有機物的種類及含量變化上可以判斷，枝孢菌BD-19對纖維素、木質素均有降解作用。