MCT1抑制劑AZD3965增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對表柔比星敏感性的作用

王先知,張 配,崇殿龍,李其響,潘 瓊,李 璐,王仲崑,魏 芳,劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:liuhao6886@foxmail.com;#共同通訊作者,E-mail:weifangmailbox@126.com)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,其病情進(jìn)展迅速、治療困難,已成為世界性難題。由于肝癌早期診斷困難,許多患者在確診時己發(fā)生肝內(nèi)播散或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,無法手術(shù)切除。因此化學(xué)治療在肝癌的治療中占據(jù)著重要地位。表柔比星(EPI)是新一代的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物,是用于肝癌治療的一線化療藥物。但隨著耐藥性的出現(xiàn)使其應(yīng)用受到很大限制。因此,尋找聯(lián)合用藥方案,增加肝癌細(xì)胞對表柔比星的敏感性,對于肝癌的治療具有重要的意義。

單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MCT1)是哺乳動物細(xì)胞膜上的一種重要跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)、pH調(diào)節(jié)以及能量代謝方面發(fā)揮重要的作用[1]。近年來,研究表明MCT1的表達(dá)和活性與癌細(xì)胞對某些化療藥物的敏感性密切相關(guān),得到廣泛關(guān)注[2-5]。目前還沒有關(guān)于MCT1調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞對表柔比星敏感性方面的研究,本課題探究MCT1抑制劑AZD3965與表柔比星聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細(xì)胞的抑制作用,并分析可能的機(jī)制,以期為肝癌的臨床治療提供新的思路和方案。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

肝癌HepG2細(xì)胞為中山大學(xué)惠贈,由蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理實(shí)驗(yàn)室凍存。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司,胎牛血清購于杭州四季青公司,噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司,AZD3965購于美國Selleck公司,表柔比星購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板,1×104個細(xì)胞/孔,培養(yǎng)24 h。分別用不同濃度AZD3965(0,10,20,40 μmol/L)、表柔比星(0,10,20,40 μmol/L)以及表柔比星(10,20,40 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞2 h再聯(lián)合20 μmol/L AZD3965處理細(xì)胞,同時設(shè)陰性對照組和空白對照組,每組設(shè)置5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入20 μl MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h,緩慢吸棄上清,每孔加入150 μl DMSO,37 ℃溫箱孵育30 min,酶標(biāo)儀在波長490 nm下檢測各孔吸光度。

1.4 集落克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板,1×104個細(xì)胞/孔,培養(yǎng)24 h。分別用4 μmol/L AZD3965、0.01 μmol/L表柔比星以及0.01 μmol/L表柔比星預(yù)處理細(xì)胞2 h聯(lián)合4 μmol/L AZD3965處理細(xì)胞,同時設(shè)空白對照組。培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5 d,終止培養(yǎng),吸棄上清并用PBS清洗2次,5%多聚甲醛-20 ℃固定15min,結(jié)晶紫室溫染色10 min,PBS清洗2次,室溫下干燥,拍照。

1.5 活細(xì)胞工作站觀察AZD3965對表柔比星在HepG2細(xì)胞內(nèi)分布的影響

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于12孔板,1.5×105個細(xì)胞/孔,培養(yǎng)24 h。分別用20 μmol/L表柔比星處理細(xì)胞4 h以及20 μmol/L表柔比星預(yù)處理細(xì)胞2 h再聯(lián)合20 μmol/L AZD3965處理細(xì)胞2 h,同時設(shè)空白對照組。吸棄上清并用冰冷的PBS清洗3次,最后每孔加入0.5 ml PBS,利用蒽環(huán)類藥物的熒光發(fā)色性,置入活細(xì)胞工作站的熒光顯微鏡下,調(diào)節(jié)適宜激發(fā)光和發(fā)射光波長,200倍鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)表柔比星的熒光情況。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測AZD3965對表柔比星在HepG2細(xì)胞內(nèi)積累的影響

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于12孔板,1.5×105個細(xì)胞/孔,培養(yǎng)24 h。分別用20 μmol/L表柔比星處理細(xì)胞4 h以及20 μmol/L表柔比星預(yù)處理細(xì)胞2 h再聯(lián)合20 μmol/L AZD3965處理細(xì)胞2 h,同時設(shè)空白對照組。冰上收集細(xì)胞,冰冷的PBS清洗2次后用0.5 ml PBS重懸細(xì)胞,利用蒽環(huán)類藥物的熒光發(fā)色性,用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)表柔比星的平均熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間差異采用單因素方差分析及t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AZD3965增強(qiáng)表柔比星對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT結(jié)果顯示,單獨(dú)使用表柔比星(10,20,40 μmol/L)處理HepG2細(xì)胞24 h的存活率分別為(61.93±3.02)%,(59.87±1.14)%,(54.15±6.14)%。20 μmol/L AZD3965作用于HepG2細(xì)胞24 h的存活率為(73.25±6.21)%。AZD3965(20 μmol/L)聯(lián)合表柔比星(10,20,40 μmol/L)處理HepG2細(xì)胞24 h,細(xì)胞存活率分別為(43.11±1.65)%,(45.27±1.09)%,(42.93±1.86)%。結(jié)果表明,在使用相同濃度的表柔比星時,與表柔比星單獨(dú)使用組比較,表柔比星和20 μmol/L AZD3965聯(lián)合使用組的細(xì)胞存活率明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

與EPI組比較,*P<0.05

2.2 AZD3965增強(qiáng)表柔比星對HepG2細(xì)胞集落克隆形成的抑制作用

為進(jìn)一步觀察AZD3965對表柔比星抑制HepG2細(xì)胞增殖作用的影響,使用4 μmol/L AZD3965和0.01 μmol/L表柔比星單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞。結(jié)果表明,與表柔比星單用組相比,表柔比星與AZD3965聯(lián)合使用時對HepG2細(xì)胞集落克隆的形成具有更加明顯的抑制作用(見圖2)。

2.3 AZD3965對表柔比星在HepG2細(xì)胞內(nèi)分布的影響

為探究AZD3965增強(qiáng)表柔比星對HepG2細(xì)胞敏感性作用的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)觀察AZD3965對表柔比星在HepG2細(xì)胞內(nèi)分布水平的影響。使用20 μmol/L表柔比星以及其聯(lián)合20 μmol/L AZD3965處理細(xì)胞,利用蒽環(huán)類藥物的熒光發(fā)色性,通過活細(xì)胞工作站觀察表柔比星在HepG2細(xì)胞內(nèi)的分布情況。結(jié)果表明,與表柔比星單用組相比,AZD3965可明顯增強(qiáng)HepG2細(xì)胞內(nèi)表柔比星的熒光強(qiáng)度(見圖3)。

A.空白對照組;B.4 μmol/LAZD3965;C. 0.01 μmol/L EPI;D. 4 μmol/LAZD3965+0.01 μmol/L EPI

2.4 AZD3965對表柔比星在HepG2細(xì)胞內(nèi)積累的影響

為定量檢測AZD3965對表柔比星在HepG2細(xì)胞內(nèi)積累水平的影響,單獨(dú)使用20 μmol/L表柔比星以及其聯(lián)合20 μmol/L AZD3965處理細(xì)胞,利用蒽環(huán)類藥物的熒光發(fā)色性,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)表柔比星的平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示,與單獨(dú)使用表柔比星相比,當(dāng)表柔比星與AZD3965聯(lián)合處理細(xì)胞時,表柔比星的熒光曲線右移,細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度ΔMFI由ΔMFIB=58 035.22增強(qiáng)至ΔMFIC=168 965.42,與熒光顯微鏡所觀察到的結(jié)果相一致(見圖4)。

A.空白對照組B. 20 μmol/L EPIC. 20 μmol/L EPI+20 μmol/L AZD3965

圖4 AZD3965增強(qiáng)表柔比星在HepG2細(xì)胞內(nèi)的積累Figure 4 AZD3965 enhanced the accumulation of epirubic in HepG2 cells

3 討論

惡性腫瘤的治療是世界性難題,尋找高效低毒的藥物治療方案是一個重要的研究方向。聯(lián)合用藥是提升藥物抗癌效果的一種重要途徑。

表柔比星(epirubicin,EPI)是蒽環(huán)類抗腫瘤藥物阿霉素的衍生物,它能快速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,抑制核酸合成和有絲分裂[6],已廣泛用于多種腫瘤的防治,如急性白血病和惡性淋巴瘤、乳腺癌、支氣管肺癌、卵巢癌、腎母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌、胃癌、肝癌包括原發(fā)性肝細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性癌等。但該藥單獨(dú)使用時,腫瘤細(xì)胞容易對其產(chǎn)生耐藥性,從而影響了整體治療效果。

腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生與細(xì)胞膜上P-糖蛋白的過表達(dá)密切相關(guān)[7,8]。P-糖蛋白能夠與多種藥物結(jié)合,由ATP提供能量,將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物逆濃度轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外,減少藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積累,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物不敏感[9,10]。而表柔比星在肝癌細(xì)胞內(nèi)蓄積的減少是肝癌細(xì)胞對其產(chǎn)生耐藥性的主要原因。因此,通過聯(lián)合用藥的方法提高表柔比星在肝癌細(xì)胞內(nèi)的積累是增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對表柔比星敏感性的潛在方向。

單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MCT1)是廣泛分布于哺乳動物細(xì)胞膜上的一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能將乳酸和H+以1 ∶1等摩爾的方式相偶聯(lián)同向轉(zhuǎn)運(yùn),從而消除糖酵解的終產(chǎn)物乳酸和H+,維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境。由于腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞的代謝更為旺盛,故更加依賴于糖酵解提供能量[11,12]。當(dāng)抑制腫瘤細(xì)胞MCT1基因表達(dá)后,可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)乳酸含量升高,進(jìn)而反饋性抑制糖酵解[13]。由于P-糖蛋白在將藥物外排過程中依賴ATP提供能量,故MCT1抑制劑可能會通過抑制糖酵解而抑制P-糖蛋白的活性,減少表柔比星從肝癌細(xì)胞內(nèi)的外排。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),當(dāng)表柔比星和MCT1抑制劑AZD3965聯(lián)合使用時,對肝癌細(xì)胞具有更加明顯的增殖抑制作用。通過進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AZD3965可使表柔比星在肝癌細(xì)胞內(nèi)的積累量增加。其機(jī)制很可能是由于MCT1抑制劑通過抑制糖酵解而抑制P-糖蛋白的活性,減少表柔比星從肝癌細(xì)胞內(nèi)的外排,使藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累量相對增加,從而逆轉(zhuǎn)了肝癌細(xì)胞對表柔比星的耐藥性,增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果。本研究為肝癌的臨床治療提供了新的治療方法和思路,也為藥物的聯(lián)合使用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)僅選用了體外培養(yǎng)的細(xì)胞株,進(jìn)一步的體內(nèi)外藥效還有待深入研究。