徐小艷， 牟 姝， 史哲溪， 王蘭芳， 李 平

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

外泌體是細(xì)胞分泌的納米級囊泡，廣泛存在于血液、尿液、乳汁等體液中[1-6]。研究發(fā)現(xiàn)牛奶中含有大量的外泌體，且外泌體可以保護(hù)其內(nèi)含的microRNAs[7-11]。超速離心法是目前獲取牛奶外泌體最常用的的方法之一[12]，但不同的研究獲取外泌體的離心力不盡相同[13-16]。本研究擬通過對不同離心力下獲取的牛奶外泌體進(jìn)行表征，探究獲取牛奶外泌體的最適離心力。

研究已發(fā)現(xiàn)牛奶外泌體具有促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖等作用[13,17]。但是，其在胃腸道的穩(wěn)定性仍不十分明確，而且消化后的牛奶外泌體是否仍對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用尚無人探究。故本課題將在之前研究[16]的基礎(chǔ)上，對牛奶外泌體在胃腸道的穩(wěn)定性進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，并初步探究牛奶消化前后外泌體對大鼠腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6)增殖的作用。

1 材料與方法

1.1 體外胃腸道消化模型

牛奶的體外消化參照以往研究[16,18-19]中使用的體外胃腸道消化模型進(jìn)行，實驗所用牛奶為從超市購買的某品牌0脂鮮牛奶。參考Tunick等[19]的研究配制模擬胃液(simulated gastric fluid, SGF)和模擬腸液(simulated intestinal fluid, SIF)。具體實驗過程如下。

在模擬胃反應(yīng)階段，100mL牛奶與50mL SGF混勻，調(diào)整pH至1.5，37℃預(yù)熱30min，置于恒溫?fù)u床內(nèi)，37℃，95r/min反應(yīng)30min。模擬胃反應(yīng)階段結(jié)束后，在上述溶液中加入150mL SIF，調(diào)整pH至7，37℃預(yù)熱30min，置于恒溫?fù)u床內(nèi)，37℃，95r/min，反應(yīng)60min。反應(yīng)完結(jié)束后，60℃水浴10min滅活消化酶以終止反應(yīng)[16]。然后，將其迅速置于冰上，直至用超速離心法提取外泌體。

因本研究后續(xù)將通過細(xì)胞增殖實驗探究消化前后的牛奶外泌體對細(xì)胞增殖的影響，為了排除模擬消化液SGF和SIF中的成分對細(xì)胞增殖的影響，本研究除了設(shè)置未消化的牛奶組(N組)和體外模型消化組(NX組)外，還設(shè)置了空白對照組(ND組)，即用純水代替牛奶在同樣條件下進(jìn)行體外消化。

1.2 獲取外泌體的離心方案

將N、NX和ND組樣品用貝克曼冷凍離心機(jī)7000×g相對離心力(relative centrifugal force, RCF)、 20000×gRCF、50000×gRCF，4℃下各離心60min，以去除脂蛋白、酪蛋白和細(xì)胞碎片等，收集上清液，棄沉淀；將收集的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，70000×gRCF，4℃離心60min，去除剩余的蛋白和大顆粒物質(zhì)，棄沉淀，收集上清液，用于下一步離心。

不同離心力外泌體的獲取步驟為： 100000×gRCF，4℃，離心60min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，130000×gRCF，4℃離心60min，再將上清液160000×gRCF，4℃離心60min。分別用適量PBS溶液溶解收集不同離心力下的沉淀。N組、NX組、ND組樣品在100000×gRCF，130000×gRCF，160000×gRCF下獲得的外泌體溶液分別標(biāo)記為N1、N2、N3、NX1、NX2、NX3、ND1、ND2、ND3。

1.3 外泌體表征

外泌體溶液的蛋白測定用上海碧云天生物技術(shù)有限公司增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒；用Western印跡法分析外泌體標(biāo)記蛋白CD63和CD9的表達(dá)[20-21]；動態(tài)光散射法(dynamic light scattering, DLS)測定外泌體粒徑，選取分散系數(shù)(polydispersity index, PDI)和數(shù)量粒度分布均值(particle size distribution number mean, PSD N M)兩個指標(biāo)分析外泌體粒徑數(shù)據(jù)[22]。外泌體的形態(tài)采用日本日立公司的S-4800掃描電子顯微鏡觀察。

1.4 細(xì)胞增殖實驗

選取對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞，分成4組，即對照組(C組)、N組、NX組和ND組。其中對照組不加任何干預(yù)，N、NX分別在培養(yǎng)基中加入50μg/mL不同離心力下獲取的消化前、消化后的牛奶外泌體進(jìn)行培養(yǎng)，ND組則加入與NX組相同體積的離心產(chǎn)物作為對照。在24、48、72h時進(jìn)行CCK8測定，計算細(xì)胞增殖率，實驗獨立重復(fù)3次。此外，為排除血清中外泌體對實驗結(jié)果的干擾，細(xì)胞增殖實驗所用血清均為去除外泌體的血清[23]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同離心力下獲得的牛奶消化前后外泌體的表征

體外消化后，牛奶外泌體蛋白濃度明顯降低，見圖1。外泌體標(biāo)記蛋白CD63和CD9在消化前后的牛奶外泌體中均為陽性，見圖2；不含牛奶的空白對照組標(biāo)記蛋白陰性。

圖1 牛奶消化前后外泌體蛋白濃度的變化Fig.1 The change of bovine exosomes protein concentration與N1組相比，**P<0.01

圖2 牛奶外泌體標(biāo)記蛋白表達(dá)Fig.2 Protein markers of bovine milk exosomes

DLS法測得的粒徑數(shù)據(jù)顯示，牛奶消化后離心獲取的外泌體的數(shù)量粒度分布均值和分散系數(shù)均大于未經(jīng)消化處理的牛奶組，消化前后的牛奶外泌體粒徑隨離心力的增加而降低，見表1、圖3。

表1 牛奶外泌體的分散系數(shù)和數(shù)量粒度分布均值

圖3 牛奶外泌體的數(shù)量粒度分布圖Fig.3 Bovine milk exosomes size distribution

掃描電鏡下觀察，N1、N2、NX1、NX2組均能觀察到類似外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但是N3、NX3組粒徑過小，形態(tài)不規(guī)則；電鏡下觀察N1內(nèi)含粒徑小、形狀不規(guī)則的雜質(zhì)，疑似混有雜蛋白，而NX1和NX2則不存在這種現(xiàn)象，見圖4。

圖4 牛奶外泌體的形態(tài)Fig.4 Characterization of bovine milk exosomes

2.2 不同離心力下獲得的牛奶消化前后外泌體對IEC-6細(xì)胞增殖的影響

實驗結(jié)果顯示，不同離心力下獲得的牛奶消化前后的外泌體處理IEC-6細(xì)胞24、48、72h后，細(xì)胞增殖率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

在24h時，N2組的細(xì)胞增殖率大于N1組(P<0.01)；而NX1、NX2和NX3三組間的細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同一離心力下獲得的N組和NX組的離心產(chǎn)物之間增殖率無明顯差別，即N1與NX1、N12與NX2、N3與NX3之間均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在48h時，N1、N2、N3三組間細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在NX中，NX2組的細(xì)胞增殖率明顯高于NX1和NX3。同一離心力下獲得的N組和NX組離心產(chǎn)物對細(xì)胞增殖有明顯不同： NX1的增殖率大于N1且NX2的增殖率大于N2(P<0.05)。

在72h時，N2和N3組的細(xì)胞增殖率大于N1(P<0.05)，NX2組的細(xì)胞增殖率大于NX1。NX1的細(xì)胞增殖率大于N1且NX2的細(xì)胞增殖率大于N2(P<0.05)，見表2。

表2 牛奶外泌體對IEC-6細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

牛奶外泌體的提取主要采用超速離心、試劑盒分離等方法[12]，用超速離心法獲取外泌體這一途徑雖然已被廣泛采用，但是，通過超速離心法獲取牛奶外泌體的離心方案不盡相同[13,16,22,24]。目前研究多用100000×g至130000×g的最終離心力獲得牛奶外泌體。本研究通過對不同離心力獲取的外泌體進(jìn)行表征，探討獲取牛奶外泌體的最適離心力。本研究發(fā)現(xiàn)，在N組離心產(chǎn)物中，外泌體標(biāo)記蛋白CD63和CD9在N1、N2和N3中均呈現(xiàn)陽性，說明不同離心力下獲得的離心產(chǎn)物都含有外泌體。但是，結(jié)合外泌體的粒徑數(shù)據(jù)和電鏡下的形態(tài)，可以看出N1的離心產(chǎn)物中含有一定量粒徑較小的雜蛋白，這些雜蛋白可能會干擾實驗結(jié)果。而N2基本上不含粒徑較小的雜蛋白；N3的粒徑過小且形狀不規(guī)則，無法斷定其內(nèi)是否混有粒徑極小的雜蛋白，且尚未有研究使用160000×g的離心力分離外泌體，故不推薦使用。因此，本研究認(rèn)為，若不采用采用其他手段(如加入EDTA等物質(zhì)[24])去除雜蛋白，而單純采用梯度離心法獲取外泌體，100000×g離心后的上清液，再經(jīng)130000×g離心分離牛奶外泌體是比較合理的離心方案。

牛奶外泌體能耐受胃腸道的消化是其被吸收發(fā)揮作用的前提。本研究通過對消化前后的牛奶外泌體進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)消化后獲取的牛奶外泌體粒徑大于未消化組，這與之前牛奶外泌體在胃腸道穩(wěn)定性的研究[16]結(jié)果存在差異。但是，結(jié)合掃描電鏡下觀察到的外泌體形態(tài)數(shù)據(jù)，本研究認(rèn)為造成上述結(jié)果的原因是N組離心產(chǎn)物混有較多粒徑較小的雜蛋白，從而導(dǎo)致N組的數(shù)量粒度分布均值低于NX組。鑒于NX組離心產(chǎn)物在標(biāo)記蛋白和形態(tài)等方面與N組一致，可以推斷牛奶中的外泌體經(jīng)過體外消化后仍有大部分存留。

牛奶外泌體有諸多功能，如促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖[13,17]及腸道的損傷修復(fù)[25]，影響哺乳動物免疫和生長發(fā)育[11]，26]，調(diào)控人體基因的表達(dá)等[27]。消化后的牛奶外泌體是否仍具有未消化的牛奶外泌體的功能目前尚無報道。本課題組在前期研究[22]中發(fā)現(xiàn)，牛奶外泌體可通過影響MAPK信號通路的表達(dá)促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，消化后的牛奶外泌體仍能促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的增殖，NX2組在48、72h的增殖率較高，且NX1和NX2組的增殖率在48、72h均分別明顯高于N1和N2組。有研究表明，蛋白酶能夠去除外泌體膜上的蛋白[24]，進(jìn)而影響腸細(xì)胞對外泌體的攝取。體外消化可能會使牛奶外泌體會發(fā)生某些變化，進(jìn)而導(dǎo)致其對細(xì)胞增殖的影響與未消化的牛奶外泌體有明顯差異。對于這一猜想還有待于在后續(xù)的實驗中作進(jìn)一步的探究和論證。