胡 娟 楊真禎 鄺素娟 連智雯 柯貴寶 廖如意 陳雪芹 馬建超 黎思嘉張 麗 李 卓 馮仲林 梁華般 林 婷 董 偉 李銳釗 李志蓮 章 斌梁馨苓 史 偉 鄧春玉1, 劉雙信

慢性腎臟病(CKD)已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，我國CKD的發(fā)病率高達(dá)10.8%，其中約1%患者發(fā)展為終末期腎病(ESRD)，且患病人數(shù)還在不斷增加中[1]。高血壓是CKD常見的并發(fā)癥，也是影響CKD患者腎功能進(jìn)展的危險(xiǎn)因素[2]。CKD患者發(fā)生高血壓的機(jī)制很多，常見因素包括體液潴留、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS) 激活、血管順應(yīng)性改變、血管鈣化等[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些血管活性劑亦會(huì)通過影響血管舒縮功能來參與調(diào)節(jié)CKD患者的血壓[4]。血管張力是影響血壓的重要因素，受到多種機(jī)體內(nèi)源性的活性物質(zhì)調(diào)節(jié)，如苯腎上腺素、血栓素等，它們通過平滑肌細(xì)胞上相應(yīng)的受體及偶聯(lián)G蛋白信號(hào)通路等機(jī)制，介導(dǎo)血管收縮。

本實(shí)驗(yàn)通過比較CKD高血壓大鼠與對照組大鼠離體血管環(huán)對常見的體內(nèi)血管活性劑刺激的反應(yīng)性及血管壁上相關(guān)受體蛋白的檢測，旨在進(jìn)一步探究CKD高血壓的發(fā)生機(jī)制，為臨床治療提供新思路。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性SD大鼠24只，6～8周齡，體重約180～200g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：44002100010960。

實(shí)驗(yàn)藥物和試劑苯腎上腺素(phenylephrine，Phe)、血栓素A2類似物(9，11-dideoxy-11,9-epoxymethanoprostaglandin，U46619)、乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)和硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)均購于Sigma公司，抗α1腎上腺素能受體抗體和抗血栓素A2受體抗體購于Abcam公司，抗L型電壓依賴性鈣離子通道抗體購于Proteintech公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。K-H液：NaCl 119 mmol/L，MgCl2·6H2O 1 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L；高鉀 K-H 液：KCl 60 mmol/L，NaCl 63.7 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgCl2·6H2O 1 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L；高鉀無鈣K-H液：即不含CaCl2的高鉀 K-H 液。以上混合液體均通5%CO2和95%O2混合氣體30 min至飽和。

實(shí)驗(yàn)儀器智能無創(chuàng)血壓計(jì)BP-98A型(北京軟隆生物技術(shù)有限公司);610M型多通道血管張力測定儀(丹麥DMT公司)；PowerLab8/30生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(澳大利亞AD公司)。

CKD模型制備24只雌性SD大鼠在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。1周后采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常對照組及CKD組。對CKD組大鼠施行5/6腎切除，正常對照(假手術(shù))組同期行手術(shù)，每次僅打開腹腔、暴露腎臟，關(guān)腹。分別于術(shù)前、術(shù)后第8、16周末取血測定各造模組大鼠血清肌酐(SCr)、血鈣、血磷及血清甲狀旁腺激素(PTH)水平。最終模型組大鼠1只因麻醉過量死亡，1只在第12周死亡，第16周時(shí)模型組大鼠存活10只，對照組大鼠全部存活(n=12)。

尾動(dòng)脈收縮壓測量術(shù)前、術(shù)后第16周，采用標(biāo)準(zhǔn)尾部測壓法測量，每只大鼠測量3次，每次間隔5 min，取平均值作為大鼠尾動(dòng)脈血壓。

大鼠胸主動(dòng)脈張力測定

離體胸主動(dòng)脈環(huán)制備 采用頸椎脫臼法處死大鼠，迅速打開腹腔，取下胸主動(dòng)脈，放入4℃、經(jīng)混合氣(含95%O2+5%CO2)飽和過的K-H液中，仔細(xì)分離周圍組織，剪取1.8～2.0 mm 長的血管環(huán)，將其固定于610M血管張力測定儀上，施予15 mN前負(fù)荷，每隔15 min換液1次，平衡60 min后，在浴槽中加入藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)全程持續(xù)通以混合氣至浴槽內(nèi)的溶液中，保持溫度在(37±0.5)℃[5]。

血管活性及內(nèi)皮完整性測定[6]用高鉀溶液(KCl 60 mmol/L)刺激胸主動(dòng)脈環(huán)，待達(dá)到收縮穩(wěn)定后，用K-H液置換浴槽內(nèi)溶液，使血管張力恢復(fù)基線水平，平衡30 min后，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)至前后兩次高鉀刺激的血管收縮幅度相差不超過10%，則可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。用血管收縮劑Phe 1 μmol/L收縮胸主動(dòng)脈，待血管達(dá)到最大收縮幅度并穩(wěn)定后，加入血管舒張劑Ach 1 μmol/L舒張血管，若舒張幅度大于60%視為內(nèi)皮完整，若舒張程度小于10%或不舒張視為內(nèi)皮去除完全。

CaCl2對血管張力的作用 用高鉀無鈣K-H溶液置換浴槽內(nèi)溶液，每隔10 min置換一次，直至血管張力恢復(fù)基線水平，再平衡30 min后，在浴槽中加入濃度梯度的CaCl2(0.001～3 mmol/L)，記錄血管張力的變化。

Phe和U46619對血管張力的作用 用K-H液置換浴槽內(nèi)溶液3～4次，使血管張力恢復(fù)基線水平，平衡30 min后，在浴槽中分別加入各濃度梯度的血管收縮劑Phe(0.001～3 μmol/L)、U46619(0.001～1 μmol/L)，觀察其作用的量效曲線。

血管舒張功能的變化 用血管收縮劑U46619 100 nmol/L收縮胸主動(dòng)脈，待血管達(dá)到最大收縮幅度并穩(wěn)定后，分別加入各濃度梯度的血管舒張劑Ach (0.001～1 μmol/L)、SNP(0.03～10 nmol/L)，記錄血管舒張的變化。

Western Blot檢測兩組大鼠胸主動(dòng)脈上相應(yīng)的受體蛋白濃度取大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)約5～8 mm，加入細(xì)胞裂解液，將組織進(jìn)行充分研磨裂解。勻漿好的組織液于離心后取細(xì)胞上清測蛋白濃度(BCA 法)，將樣品調(diào)至等量等體積，加入變性液 100 ℃加熱變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。用聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉1h，分別用相應(yīng)的抗α1腎上腺素能受體抗體(1∶ 1 000)、抗血栓素A2受體抗體(1∶ 1 000 )和抗L型電壓依賴性鈣離子通道抗體(1∶ 2 000) 4 ℃ 孵育過夜。緩沖液洗膜后，相應(yīng)二抗(1∶ 5 000)室溫孵育1h。用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin(1∶ 5 000)作內(nèi)參照，掃描灰度值并測定蛋白表達(dá)相對含量。

統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理標(biāo)準(zhǔn)值100%為連續(xù)兩次高鉀所誘發(fā)的最大收縮張力的均值，用測得的收縮值/標(biāo)準(zhǔn)值的百分比來表示收縮幅度。Emax表示最大收縮/舒張幅度，pEC50為產(chǎn)生最大效應(yīng)的50%時(shí)激動(dòng)劑摩爾濃度的負(fù)對數(shù)。均數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SigmPlot軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組大鼠血液學(xué)指標(biāo)及血壓對比與造模前及同期正常對照組相比，造模8周時(shí)模型組出現(xiàn)了SCr升高、PTH升高、低鈣高磷的典型CKD早期表現(xiàn)。隨著病程的發(fā)展，第16周時(shí)模型組SCr升至78.1±18.70 μmol/L，較術(shù)前及同期對照組大鼠SCr均明顯上升，提示模型組大鼠已進(jìn)入CKD，并出現(xiàn)繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)(PTH 53.88±12.88 pg/ml)及高鈣高磷等CKD相關(guān)并發(fā)癥。同時(shí)，第16周時(shí)模型組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓及舒張壓較對照組均顯著升高(收縮壓160.50±17.33 mmHgvs137.00±7.65 mmHg，P<0.05；舒張壓95.17±8.13 mmHgvs82.80±8.87 mmHg)，提示造模成功(表1)。

血管收縮劑及舒張劑對血管張力的影響

高鉀溶液、CaCl2誘導(dǎo)兩組大鼠胸主動(dòng)脈收縮反應(yīng)的差異 在高鉀及CaCl2刺激下，兩組大鼠血管收縮無明顯差異(表2、圖1)。高鉀及CaCl2均主要通過直接引起鈣離子內(nèi)流從而觸發(fā)血管收縮，該結(jié)果提示模型組大鼠胸主動(dòng)脈對鈣離子敏感性及反應(yīng)性未發(fā)生改變。

表1 兩組大鼠血清肌酐、鈣、磷、甲狀旁腺激素及收縮壓的比較

CKD：慢性腎臟?。?:與對照組比較，P<0.05；#:與0周比較，P<0.05

表2兩組大鼠胸主動(dòng)脈對血管收縮劑的敏感性及最大收縮力

處理分組pEC50Emax高鉀溶液對照組33.24±6.56CKD31.57±4.63CaCl2對照組3.20±0.05103.75±14.51CKD3.05±0.03110.33±14.41Phe對照組7.21±0.0665.49±27.02CKD7.14±0.0660.31±13.54U46619對照組7.35±0.11121.39±15.47CKD7.51±0.04162.66±14.29**

CKD：慢性腎臟??；CaCl2：氯化鈣溶液；Phe：苯腎上腺素；U46619：血栓素A2類似物；pEC50：產(chǎn)生最大效應(yīng)的50%時(shí)激動(dòng)劑摩爾濃度的負(fù)對數(shù)；Emax：最大收縮/舒張幅度；**：與對照組比較，P<0.01

圖1 高鉀、氯化鈣作用下兩組大鼠胸主動(dòng)脈張力變化CKD：慢性腎臟?。籄：高鉀溶液(60 mmol/L)刺激下兩組大鼠胸主動(dòng)脈張力變化相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；B：累計(jì)濃度梯度CaCl2(0.001～3 mmol/L)刺激下兩組大鼠胸主動(dòng)脈張力變化擬合圖相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

Phe、U46619誘導(dǎo)兩組大鼠胸主動(dòng)脈收縮反應(yīng) 由表2、圖2可知，在Phe刺激下，兩組大鼠血管收縮無明顯差異。而在U46619作用下，CKD組大鼠血管收縮量效曲線的Emax明顯高于對照組(162.66±14.29vs121.39±15.47，P<0.01)，兩組間pEC50無明顯差異，說明在同劑量的U46619刺激下，CKD大鼠胸主動(dòng)脈會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的收縮力。

Ach及SNP對胸主動(dòng)脈舒張功能的影響 表3、圖3提示CKD組大鼠胸主動(dòng)脈在Ach和SNP作用下，其最大舒張幅度均小于對照組(P<0.01)。其中Ach介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能下降較明顯 (67.78±6.18vs83.92±5.42,P<0.01)，但兩組pEC50無差異；SNP作用時(shí)，CKD血管舒張率亦有下降(95.45±1.33vs98.90±0.60,P<0.01)，且其pEC50明顯小于對照組(P<0.05)，說明CKD大鼠胸主動(dòng)脈對SNP的敏感性減弱。提示CKD大鼠胸主動(dòng)脈舒張功能受損。

表3兩組大鼠胸主動(dòng)脈對血管舒張劑的敏感性及最大收縮力

處理分組pEC50EmaxAch對照組7.40±0.0483.92±5.42CKD組7.41±0.03 67.78±6.18**SNP對照組9.74±0.0298.90±0.60CKD組9.45±0.03*95.45±1.33**

CKD：慢性腎臟??；Ach：乙酰膽堿；SNP：硝普鈉；pEC50：產(chǎn)生最大效應(yīng)的50%時(shí)激動(dòng)劑摩爾濃度的負(fù)對數(shù)；Emax：最大收縮/舒張幅度；與對照組比較，*:P<0.05，**:P<0.01

兩組大鼠胸主動(dòng)脈相關(guān)受體蛋白分布的差異TXA2受體蛋白為U46619的作用靶點(diǎn)，其在CKD組大鼠胸主動(dòng)脈上的表達(dá)明顯高于對照組，而KCl和Phe的作用靶點(diǎn)L-型鈣通道蛋白和α1受體蛋白在兩組的表達(dá)中沒有差別(圖4)。

討 論

本研究通過測定血管張力，發(fā)現(xiàn)CKD大鼠胸主動(dòng)脈對血栓素A2類似物刺激產(chǎn)生的收縮力明顯增強(qiáng)，且其血管上TXA2受體蛋白亦明顯增多。表明CKD大鼠高血壓的發(fā)生可能與血栓素A2之間有一定聯(lián)系。

圖2 U46619、Phe作用下兩組大鼠胸主動(dòng)脈張力變化CKD：慢性腎臟病；Phe:苯腎上腺素；U46619:血栓素A2類似物；A～C:累計(jì)濃度梯度Phe(0.001～3 μmol/L)刺激下兩組大鼠胸主動(dòng)脈的收縮率變化(A、B分別為對照組和CKD組的張力變化圖，C為擬合圖)；D～F:累計(jì)濃度梯度U46619(0.001～1 μmol/L)刺激下兩組大鼠胸主動(dòng)脈的收縮率變化(D、E分別為對照組和CKD組的張力變化圖，F(xiàn)為擬合圖)；** :與對照組比較，P<0.01

圖3 Ach、SNP作用下兩組大鼠胸主動(dòng)脈舒張功能變化CKD：慢性腎臟??；Ach:乙酰膽堿；SNP：硝普鈉；A～C:累計(jì)濃度梯度Ach(0.001～1 μmol/L)刺激下兩組大鼠胸主動(dòng)脈的收縮率變化(A、B分別為對照組和CKD組的張力變化圖，C為擬合圖)；D～F:累計(jì)濃度梯度SNP(0.03～10 nmol/L)刺激下兩組大鼠胸主動(dòng)脈的收縮率變化(D、E分別為對照組和CKD組的張力變化圖，F(xiàn)為擬合圖)；** ：與對照組比較，P<0.01

圖4 兩組大鼠胸主動(dòng)脈相關(guān)受體蛋白分布的差異CKD：慢性腎臟?。沪?：α型腎上腺素能受體蛋白；TXA2：血栓素A2受體蛋白；Cav1.2：L-型鈣通道蛋白；** ：與對照組比較，P<0.01，(n=3)

TXA2是花生四烯酸通過環(huán)氧合酶途徑代謝后的產(chǎn)物，是一種有效的血管收縮劑和血小板聚集劑。其通過血栓素-前列腺素受體發(fā)揮作用，參與許多心血管疾病如缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化和血管損傷等[7-8]。在腎臟方面，TXA2可引起腎血管強(qiáng)烈收縮，使腎血流量及腎小球?yàn)V過率下降[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，CKD 3～4期患者尿液中血栓素代謝產(chǎn)物的排泄量較CKD 1～2期患者明顯增加，說明隨著腎功能的減退，CKD患者血液中TXA2的含量會(huì)進(jìn)一步升高[10]。本研究表明，CKD大鼠胸主動(dòng)脈對Phe及CaCl2刺激下的收縮力較對照組無明顯變化，而對U46619反應(yīng)明顯增強(qiáng)，其主要原因正是由于CKD大鼠胸主動(dòng)脈上TXA2受體較對照組增多。這提示我們在CKD個(gè)體不僅循環(huán)中的TXA2濃度升高，TXA2受體亦增多，兩者相互作用，使TXA2的不良效應(yīng)被雙重放大，進(jìn)一步強(qiáng)烈收縮血管，導(dǎo)致高血壓，影響CKD患者預(yù)后。抑制TAX2生成或阻斷其受體或許可延緩CKD的進(jìn)展[11,12]，一項(xiàng)瑞典的隊(duì)列研究隨訪了801例CKD患者5～7年的腎功能變化，結(jié)果顯示長期服用阿司匹林的患者其腎功能進(jìn)展較未服藥組減慢[13]。但對于CKD患者來說，常規(guī)劑量的阿司匹林可能不具備有效抑制循環(huán)中TXA2產(chǎn)生的效應(yīng)，使得CKD患者CVD發(fā)生率及死亡率明顯升高[14-15]。根據(jù)本研究結(jié)果，我們猜想可能是由于TAX2受體蛋白的增多，所以需采用較高劑量的拮抗劑才能抑制其不良效應(yīng)，但其有效性還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還研究了CKD高血壓大鼠的血管舒張功能，發(fā)現(xiàn)CKD大鼠胸主動(dòng)脈舒張功能減弱，其中對Ach介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能受損較明顯，SNP介導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張功能亦有下降，但幅度較小。血管內(nèi)皮是調(diào)節(jié)血管舒縮功能的重要因素，主要通過NO激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶合成環(huán)磷酸鳥苷，從而發(fā)揮舒張血管的作用[16]。CKD 患者常伴微炎癥狀態(tài)、尿毒癥毒素及脂質(zhì)代謝異常等，這些均會(huì)引起血管內(nèi)皮的損傷[17]。內(nèi)皮功能受損直接影響血管的舒張功能，導(dǎo)致血管順應(yīng)性下降，血壓升高[18]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CKD高血壓大鼠胸主動(dòng)脈TXA2受體蛋白增多，從而導(dǎo)致其對TXA2類似物刺激收縮力增強(qiáng)。提示CKD個(gè)體中高血壓的發(fā)生除了常見的傳統(tǒng)因素外，或許還跟TXA2及血管舒張功能減退相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)可能將豐富CKD發(fā)生高血壓的機(jī)制，可為其治療提供新思路。但至于CKD大鼠血管上TXA2受體蛋白增多的機(jī)制，該受體蛋白的增多在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起到多大的作用，使用TXA2阻斷劑對治療CKD個(gè)體的高血壓是否有效，這些問題還有待進(jìn)一步探究。