劉治桓 王忻 吳浩華 常寶生

強(qiáng)直性脊柱炎 ( ankylosing spondylitis，AS ) 是一種血清類風(fēng)濕因子陰性的慢性炎癥性自身免疫性疾病，以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱附著點(diǎn)炎癥為主要病理改變，并常可累及眼、肺、肌肉等關(guān)節(jié)外組織，是最常見的脊柱關(guān)節(jié)病之一[1-2]。AS 發(fā)病的具體機(jī)制尚不明確，可能由遺傳、感染及自身免疫功能異常等多因素共同作用所致，目前多數(shù)研究一致認(rèn)為基因遺傳因素是 AS 發(fā)病最主要的原因，對 AS發(fā)病的貢獻(xiàn)可能超過 90%[2-4]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶( angiotensin-converting enzyme，ACE ) 是腎素－血管緊張素系統(tǒng) ( renin-angiotensin system，RAS ) 的重要組成成分，并可通過刺激細(xì)胞因子生成參與機(jī)體炎癥調(diào)節(jié)過程。ACE 基因插入 ( insertion，I ) / 缺失( deletion，D ) 多態(tài)性位點(diǎn)是目前關(guān)于 ACE 基因開展研究最多的位點(diǎn)之一，可直接調(diào)節(jié)血清 ACE 生成及活性，已有研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡及甲狀腺自身免疫性疾病等多種自身免疫疾病與 ACE 基因 I / D 多態(tài)性相關(guān)[5-7]?；谏鲜鲅芯孔C據(jù)，筆者認(rèn)為有理由推測 ACE 基因 I / D 多態(tài)性可能與 AS 發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)。本研究以我國陜西漢族人群為研究對象，觀察ACE 基因 I / D 多態(tài)性與 AS 的相關(guān)性，為臨床工作提供參考。

資料與方法

一、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) AS 診斷參照 1984 年美國風(fēng)濕病協(xié)會修訂的 AS 診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；( 2 ) HLA-B27 陽性；( 3 ) 陜西地區(qū)漢族人，彼此無血緣關(guān)系；( 4 ) 隨訪資料完整。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 合并其它自身免疫性疾??；( 2 ) 合并嚴(yán)重肝臟、腎臟疾病，重度感染；( 3 ) 合并惡性腫瘤和血液性疾??；( 4 ) 妊娠期女性。

二、一般資料

連續(xù)性選擇 2015 年 1 月至 2017 年 1 月于我科住院治療的 144 例 AS 患者納入 AS 組，其中男 92 例，女 52 例，平均年齡 ( 43.8±8.9 ) 歲。另外，從同期在我科治療的非 AS 患者中隨機(jī)選擇 160 名作為對照組，滿足 HLA-B27 陰性，其中男 104 名，女 56 名，平均年齡 ( 42.5±10.2 ) 歲。本研究通過本院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有入組成員均簽署知情同意書。

三、方法

1. 臨床資料收集：包括年齡、性別、病史等基本信息，以及骶髂關(guān)節(jié) X 線片檢查、眼科檢查和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果。

2. 基因組 DNA 提?。翰杉宄靠崭箷r外周靜脈血用于實(shí)驗(yàn)室檢查，部分樣本采用 DNA 提取試劑盒 ( 天根生化科技有限公司，北京 ) 提取全血基因組DNA。

3. 基因多態(tài)性檢測：采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測 ACE 基因 I / D 多態(tài)性。PCR 反應(yīng)體系 ( 25 μl ) 包括：10×Buffer 2.5 μl，上、下游引物各 1 μl ( 上游：5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’；下游：5’-GATGTGGCC ATCACATTCGTCAGAT-3’ )，dNTP混合物 2 μl，TaqDNA 聚合酶 0.25 μl，模板 DNA 1 μl，不足部分由滅菌蒸餾水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性 4 min，然后按照變性 95 ℃ 20 s、退火65 ℃ 30 s、延長 72 ℃ 50 s 的順序循環(huán) 30 個周期，最后 72 ℃ 延長 3 min。最后取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察并攝片。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，AS 組與對照組患者年齡比較采用t檢驗(yàn)，余計數(shù)資料結(jié)果均以構(gòu)成百分比 ( % ) 表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)?；蛐头植疾捎?Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)。采用比值比 ( odd ratio，OR) 及其 95% 可信區(qū)間( confidence interval，CI) 表示相對風(fēng)險度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組間基線資料比較

AS 組共納入 144 例，其中男 92 例，女 52 例，平均年齡 ( 43.8±8.9 ) 歲；對照組共納入 160 名，其中男 100 名，女 60 名，平均年齡 ( 42.5±10.2 )歲，兩組患者性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＝0.802；P＝0.259 )。

二、Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果

如圖 1，ACE 基因 I / D 多態(tài)性位點(diǎn)基因型包括II，ID 和 DD 三種，本研究兩組基因型分布經(jīng)檢驗(yàn)均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡 (P＞0.05 )，具有群體代表性。

圖 1 ACE 基因 I / D 多態(tài)性 PCR 結(jié)果 ( M：marker；1,5：II 基因型；2,4：ID 基因型；3：DD 基因型 )Fig.1 PCR results of ACE gene I / D polymorphism ( M: Marker;1,5: II genotype; 2,4: ID genotype; 3: DD genotype )

三、ACE 基因 I / D 多態(tài)性與 AS 易感性的關(guān)系

如表 1，AS 組與對照組比較，ACE 基因 I / D 多態(tài)性位點(diǎn)在和顯性基因模型，隱性基因模型和等位基因模型下差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05 )。

四、ACE 基因 I / D 多態(tài)性與 AS 疾病進(jìn)展的關(guān)系

如表 2，高骶髂關(guān)節(jié)炎 X 線分期 ( III 期＋I(xiàn)V 期 )患者與低分期 ( 0 期＋I(xiàn) 期＋I(xiàn)I 期 ) 患者比較，ACE基因 I / D 多態(tài)性位點(diǎn)等位基因分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＝0.092 )，合并眼部病變患者與無眼部病變患者比較，ACE 基因 I / D 多態(tài)性位點(diǎn)等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＝0.001 )。

表 1 ACE 基因 I / D 多態(tài)性與 AS 易感性的關(guān)系Tab.1 Association between ACE gene polymorphism and AS susceptibility

表 2 ACE 基因 I / D 多態(tài)性與 AS 疾病進(jìn)展的關(guān)系Tab.2 Association between ACE gene polymorphism and progression of AS

討 論

基于最新全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示基因遺傳因素對 AS 發(fā)病的貢獻(xiàn)超過 90%，AS 患者一級親屬AS 發(fā)病率為 8%，但二級親屬 AS 發(fā)病率不足 1%，對于 HLA-B27 陽性的一級親屬發(fā)病率為 12%，HLA-B27 陰性的一級親屬發(fā)病率也不足 1%[9]。長期以來 AS 的相關(guān)基因遺傳學(xué)研究主要針對 HLA-B27，目前研究結(jié)果證實(shí) HLA-B27 與 AS 發(fā)病密切相關(guān)，正常人群中 HLA-B27 陽性率僅約為 5%，其中 1% 左右可能發(fā)展為 AS，而在 AS 患者人群中HLA-B27 陽性率超過 90%[10]。然而，有研究指出HLA-B27 的總遺傳度僅約為 20%～30%，提示 HLA基因以外，存在其它 AS 發(fā)病遺傳易感性位點(diǎn)[11]。近年來相繼有研究發(fā)現(xiàn)地中海熱 ( mediterranean fever，MEFE ) 基因，CCR4-NOT 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體亞基-3( CCR4-NOT transcription complex subunit 3，CNOT3 )基因及白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體-2 ( leukocyteassociated immunoglobulin-like receptor 2，LAIR2 ) 基因等也存在 AS 遺傳易感位點(diǎn)[11]。

ACE 基因位于第 17 號染色體，全長 21 kb，包含 26 個外顯子和 25 個內(nèi)含子，第 16 個內(nèi)含子中存在 1 個 287 bp 的 I / D 變異。近年來研究發(fā)現(xiàn) ACE 基因 I / D 多態(tài)性與多種疾病易感性相關(guān)，其中包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，甲狀腺自身免疫病及潰瘍性結(jié)腸炎等慢性炎癥性自身免疫性疾病[5-7]。其具體機(jī)制目前尚不明確，可能在于 ACE 可通過刺激細(xì)胞因子生成參與機(jī)體炎癥調(diào)節(jié)過程，而血清ACE 濃度及活性均受 ACE 基因 I / D 基因型影響，越來越多研究證實(shí) ACE 基因 I / D 多態(tài)性與 ACE 生成及活性密切相關(guān)，DD 基因型人群血清 ACE 水平最高，ID 基因型次之，II 基因型最低[5]。另外，ACE基因還存在其它多個多態(tài)性位點(diǎn)被證實(shí)與疾病易感性相關(guān)，如 rs4309、rs4343 位點(diǎn)多態(tài)性可能與阿爾茲海默病易感性相關(guān)[12]。

Inanir 等[11]以中東地區(qū)人群為研究對象，發(fā)現(xiàn)ACE 基因 I / D 多態(tài)性與 AS 易感性密切相關(guān)。然而研究結(jié)果顯示不同種族人群 ACE 基因 I / D 多態(tài)性分布頻率差異較大，高加索人群中 D 等位基因頻率可高達(dá) 60%，東亞人僅為 35% 左右[13]，因此有必要就不同種族、不同地區(qū)人群，分別觀察 ACE 基因 I / D 多態(tài)性與 AS 易感性的相關(guān)性。李維等[13]以重慶地區(qū)漢族人群為研究對象，發(fā)現(xiàn) AS 組和健康對照組 D 等位基因頻率分別為 69.5% 和 38.9%；本研究結(jié)果與之基本相符，兩組 D 等位基因頻率分別為 66.3% 和 36.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明對于北方漢族人 ACE 基因 I / D 多態(tài)性與 AS 易感性密切相關(guān)。Hamersma 等[14]一項(xiàng)臨床研究共納入 384 例AS 患者，嘗試觀察環(huán)境因素和基因因素在 AS 疾病進(jìn)展中的作用，結(jié)果顯示基因因素對 AS 疾病進(jìn)展的貢獻(xiàn)超過 90%。本研究結(jié)果顯示 ACE 基因 I / D 多態(tài)性與骶髂關(guān)節(jié)炎 X 線分期無顯著相關(guān)性，高分期( III 期＋I(xiàn)V 期 ) 患者與低分期 ( 0 期＋I(xiàn) 期＋I(xiàn)I 期 ) 比較，D 等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，筆者分析高分期和低分期患者 D 等位基因頻率分別為 63.9%和 36.1%，但χ2檢驗(yàn)結(jié)果兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與本研究納入樣本量較少相關(guān)，期待后續(xù)大樣本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，眼部病變作為 AS 患者最常見的關(guān)節(jié)外病變，約有 25%～30% 患者可出現(xiàn)結(jié)膜炎，虹膜炎，眼色素層炎或葡萄膜炎，眼部病變與 AS 嚴(yán)重程度無明顯關(guān)聯(lián)，但如若處理不當(dāng)可能導(dǎo)致患者青光眼，甚至失明，因此探討基因遺傳因素與 AS 患者合并眼部病變的關(guān)系具有重要意義。本研究結(jié)果顯示合并眼部病變的 AS 患者 D 等位基因頻率顯著增高，提示 ACE 基因 I / D 多態(tài)性可能與AS 患者合并眼部病變密切相關(guān)。

綜上所述，ACE 基因 I / D 多態(tài)性可能與 AS 易感性及疾病進(jìn)展均密切相關(guān)。然而本研究也存在不足之處：首先，由于真實(shí)世界中 HLA-B27 陽性的正常健康人及 HLA-B27 陰性的 AS 患者均較少，本研究 AS 組納入患者均為 HLA-B27 陽性，對照組納入對象均為 HLA-B27 陰性，期待后續(xù)有研究納入病例組及對照組完全為 HLA-B27 陽性或完全為 HLA-B27 陰性，減少 HLA-B27 對研究結(jié)果的影響；其次，ACE 基因包括等多個多態(tài)性位點(diǎn)，對于其它位點(diǎn)多態(tài)性與 AS 易感性的關(guān)系以及多個位點(diǎn)之間的相互關(guān)系尚不明確，也期待后續(xù)進(jìn)一步研究；最后，本研究僅為單中心研究結(jié)果，共納入 AS 患者144 例，樣本量較少，期待后續(xù)多中心大樣本研究結(jié)果加以驗(yàn)證。