盧福芝，錢豐，周燕霞，李啟虔，覃擁靈

（1.河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院廣西高校微生物及植物資源開發(fā)利用實(shí)驗(yàn)室，廣西宜州546300；2.廣西泰美新材料有限公司，廣西宜州546311）

米酒是以優(yōu)質(zhì)大米為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成，甘飴可口，風(fēng)味獨(dú)特，深受人們喜愛[1]。米酒發(fā)酵過程是混菌發(fā)酵，多菌種間的相互關(guān)系及其代謝協(xié)調(diào)關(guān)系對(duì)米酒的質(zhì)量起著決定性的作用[2]。酒曲中的優(yōu)勢(shì)菌種一般為霉菌、酵母菌、細(xì)菌3種，其中霉菌和酵母菌在米酒發(fā)酵中起著重要作用，霉菌主要進(jìn)行糖化作用，酵母菌則主要產(chǎn)酒精和芳香類物質(zhì)[3-5]。尤小龍、呂南拳等通過研究發(fā)現(xiàn)酒曲中功能菌生態(tài)對(duì)白酒基酒的風(fēng)味風(fēng)格起著重要的作用[6-7]。

試驗(yàn)以米酒酒曲中分離出的3株優(yōu)勢(shì)功能菌根霉菌F1、毛霉菌F2和酵母菌F3為出發(fā)菌株，分別通過單菌和混菌發(fā)酵，檢測(cè)其發(fā)酵過程發(fā)酵液中pH值、還原糖及乙醇含量的變化，并測(cè)定發(fā)酵液中酒體成分，研究菌株間的發(fā)酵規(guī)律及相關(guān)性，為米酒酒曲的制作及發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

從米酒酒曲中分離出的一株根霉菌F1、一株毛霉菌F2和一株釀酒酵母F3，其中根霉菌F1糖化酶活性較高，3株菌株均具有單獨(dú)產(chǎn)酒精能力[8]。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、淀粉：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硫酸鎂、硝酸鉀：西隴化工股份有限公司；蛋白胨：杭州百思生物技術(shù)有限公司，以上試劑均分析純；乙醇標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

將市售優(yōu)質(zhì)大米用水清洗、瀝干水分，稱取25 g大米置于250 mL的三角瓶中，加入15 mL水，加塞包扎，置于高壓滅菌鍋中121℃蒸煮滅菌20 min，使米粒熟而不爛，保證顆粒完整。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50滅菌鍋：華粵行儀器有限公司；xMark酶標(biāo)儀：上海研域設(shè)備有限公司；7890A氣相色譜儀：中國(guó)惠普有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將保藏的根霉菌F1和毛霉菌F2接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，待長(zhǎng)出孢子后取出，在無菌環(huán)境下將斜面中的孢子用無菌水洗脫，制成6×107cfu/mL的菌懸液；將保藏的釀酒酵母F3接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后用無菌水制成菌種數(shù)為6×107cfu/mL的菌懸液。

1.3.2 發(fā)酵試驗(yàn)

在無菌的環(huán)境下，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入80 mL的無菌水，用玻璃棒將米粒打散，然后分別接種，于28℃進(jìn)行單菌和混菌發(fā)酵，定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液的還原糖和乙醇含量。單菌發(fā)酵時(shí)，菌種F1、F2和F3的接種量均為1.5 mL；3株菌種進(jìn)行兩兩混菌發(fā)酵時(shí)，接種量分別為0.75 mL；3株菌種混合發(fā)酵時(shí)接種量各為0.5 mL。

1.3.3 發(fā)酵過程發(fā)酵液中pH值的測(cè)定

取發(fā)酵液于離心管中，10 000 r/min離心10 min。取出上清液，測(cè)定發(fā)酵液的pH值，并把相關(guān)數(shù)據(jù)記錄下來。

1.3.4 發(fā)酵過程發(fā)酵液中還原糖含量的測(cè)定

取發(fā)酵液于離心管中，10 000 r/min，離心10 min。取出上清液，通過DNS法測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的含量[9-10]。

1.3.5 發(fā)酵過程發(fā)酵液中乙醇含量的測(cè)定

將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入蒸餾器進(jìn)行蒸餾，收集蒸餾組分。蒸餾組分別用微孔濾膜過濾后，裝入樣品瓶中，通過氣相色譜利用外標(biāo)法測(cè)定發(fā)酵液中乙醇含量。色譜條件如下：柱溫40℃，保留1 min，以4℃/min升至55℃，再以40℃/min升至210℃，保留7 min；進(jìn)樣口溫度220 ℃；檢測(cè)器溫度 300 ℃；載氣（N2）：25 mL/min；H2（30 mL/min）；空氣 400 mL/min。進(jìn)樣量為 1 μL，分流比為 1 ∶30。

1.3.6 發(fā)酵液中酒體成分的測(cè)定

將發(fā)酵液經(jīng)蒸餾所得餾分過濾后通過氣相色譜測(cè)定酒體成分，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較分析，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)推定出酒體成分。色譜條件與1.3.5中的條件一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程發(fā)酵液中pH值的變化情況

根據(jù)1.3.3的方法定時(shí)取樣測(cè)定單菌和混菌發(fā)酵過程發(fā)酵液中的pH值。檢測(cè)結(jié)果顯示3株優(yōu)勢(shì)功能菌發(fā)酵過程發(fā)酵液中pH值雖有波動(dòng)，但變化較小。單菌發(fā)酵時(shí)，3株優(yōu)勢(shì)功能菌發(fā)酵過程中pH值偏酸性，變化范圍在5～6之間。在混菌發(fā)酵過程中的pH值呈弱酸性至中性，波動(dòng)范圍在5～7之間。發(fā)酵過程中pH值的變化主要是由于發(fā)酵菌種代謝產(chǎn)生的結(jié)果。菌種在發(fā)酵過程中將糖類物質(zhì)代謝產(chǎn)酸，pH值會(huì)有所下降；在產(chǎn)酸的同時(shí)菌種也會(huì)將酸不斷轉(zhuǎn)化為酯、醛、酮等物質(zhì)，因此整個(gè)發(fā)酵過程中pH值保持在了相對(duì)較小的變化范圍[11]。

2.2 發(fā)酵過程發(fā)酵液中還原糖和酒精含量的變化規(guī)律

根據(jù)1.3.4和1.3.5的方法定時(shí)取樣測(cè)定單菌和混菌發(fā)酵過程發(fā)酵液中還原糖和乙醇的含量。測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

米酒釀造過程中，菌種通過水解淀粉產(chǎn)生葡萄糖等還原性糖，所產(chǎn)的糖類一部分用于菌種的生長(zhǎng)繁殖，其他的可通過菌種的各種代謝途徑產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，其中重要的產(chǎn)物就是乙醇[12]。發(fā)酵過程發(fā)酵液中還原糖和乙醇含量的變化，一定程度上可以反映糖化和發(fā)酵速度。

圖1 菌株發(fā)酵過程發(fā)酵液中還原糖和乙醇含量的變化Fig.1 The changes of reducing sugar and ethanol content in fermentation

由圖1A、1B、1C可知，在單菌發(fā)酵過程中根霉菌F1在前5天還原糖含量急劇降低，而后保持穩(wěn)定，在發(fā)酵一開始就產(chǎn)生大量的乙醇，乙醇含量在前5天保持穩(wěn)步增加，此后開始迅速增加，第9天時(shí)達(dá)240 g/L，說明發(fā)酵前期F1主要處于菌體繁殖階段，后期開始快速發(fā)酵產(chǎn)乙醇，隨著發(fā)酵推進(jìn)，對(duì)還原糖利用速度超過了降解速度，導(dǎo)致還原糖含量不斷減少，到發(fā)酵后期發(fā)酵速度減緩，糖化和發(fā)酵速度達(dá)到平衡，因此還原糖含量保持穩(wěn)定，乙醇則不斷積累；毛霉菌F2在發(fā)酵前5天還原糖含量逐漸增加，在5 d～7 d時(shí)有所降低，乙醇含量前期緩慢增加，第7天開始急速增加，說明F2在發(fā)酵前期處于生長(zhǎng)繁殖階段，對(duì)還原糖利用較少，發(fā)酵后期開始消耗還原糖進(jìn)行代謝活動(dòng)，所以還原糖含量有所下降，開始大量生產(chǎn)乙醇，這說明毛霉菌F2具有不錯(cuò)的糖化能力，但其同時(shí)具備產(chǎn)乙醇的代謝途徑，也能利用部分還原糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇。酵母菌F3在發(fā)酵前5天還原糖含量逐漸增加，第5天后基本保持不變，說明其具有一定的水解淀粉能力但酵母菌水解淀粉的能力是有限的，在整個(gè)發(fā)酵過程中乙醇含量總體很低，造成乙醇產(chǎn)量較少的原因可能是由于水解所得的糖類需優(yōu)先滿足酵母菌的生長(zhǎng)繁殖需要，然后是才產(chǎn)乙醇。

由圖1D、1E、1F和1G可知，根霉菌F1和毛霉菌F2混菌發(fā)酵過程中還原糖含量變化不大，說明菌種的糖化速度和發(fā)酵速度基本一致，乙醇則不斷積累，達(dá)到較高水平；根霉菌F1和酵母菌F3混菌發(fā)酵過程中前5天還原糖含量迅速增加，在5 d～7 d時(shí)下降較快，而后保持穩(wěn)定，說明F1和F3混菌發(fā)酵前期水解淀粉的速度較快，隨著菌體快速繁殖，代謝作用加快，還原糖大量消耗，發(fā)酵后期代謝減緩，還原糖含量保持穩(wěn)定，乙醇在發(fā)酵過程中不斷積累，總體含量不高；毛霉菌F2和酵母菌F3混菌發(fā)酵過程還原糖含量基本保持穩(wěn)定，說明菌種的糖化速度和發(fā)酵速度較為平衡，乙醇則快速積累，經(jīng)過9天發(fā)酵后，產(chǎn)量達(dá)207 g/L；3菌混菌發(fā)酵過程中還原糖含量變化不大，乙醇不斷積累，但總體含量低。

混菌發(fā)酵時(shí)，菌株的生長(zhǎng)繁殖和代謝活動(dòng)會(huì)受彼此的影響。通過對(duì)比圖1中單菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵時(shí)還原糖和乙醇含量發(fā)現(xiàn)，單菌發(fā)酵時(shí)根霉菌F1產(chǎn)乙醇最高，而毛霉菌F2和酵母菌F3產(chǎn)乙醇均較低，但混菌發(fā)酵時(shí)，F(xiàn)2和F3的混菌發(fā)酵組合產(chǎn)乙醇量卻是最高，說明F2和F3混菌發(fā)酵時(shí)對(duì)彼此的生長(zhǎng)及代謝有促進(jìn)作用，使產(chǎn)乙醇含量增加。F1、F2和F3三者混菌發(fā)酵時(shí)產(chǎn)乙醇是4組混菌發(fā)酵中最低的，說明3株菌共同生長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)乙醇代謝途徑受到了制約。

2.3 發(fā)酵液中酒體成分測(cè)定結(jié)果

將3株優(yōu)勢(shì)功能菌根霉菌F1、毛霉菌F2和酵母菌F3分別經(jīng)單獨(dú)和混菌發(fā)酵后通過氣相色譜儀測(cè)定其酒氣成分，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，3株優(yōu)勢(shì)功能菌單菌發(fā)酵時(shí)酒體成分較為類似，其共有成分為甲醇、乙醇、乙醛、異丁醇、丁酸異戊酯。酵母菌F3酒體成分中酯類較多，含丁酸異戊酯、丁酸己酯和乳酸乙酯3種酯類；毛霉菌F2菌酒體成分多了己酸己酯。混菌發(fā)酵時(shí)共有的酒體成分有甲醇、乙醇、異丁醇和丁酸異戊酯?；炀l(fā)酵時(shí)，根霉菌F1和毛霉菌F2兩菌混菌發(fā)酵和3菌混菌共發(fā)酵所得酒體成分較多，其中F1和F2混菌發(fā)酵多了乙酸、丁酸己酯、乳酸乙酯和丙三醇，三菌混菌發(fā)酵多了乙酸、正丁酸和己酸己酯，這兩種混菌發(fā)酵方式較單菌發(fā)酵和其他兩種混菌發(fā)酵其酒體成分中多了酸類物質(zhì)。白酒香味成分有醇類、酯類、酸類和醛類等，每種成分都對(duì)白酒的風(fēng)味有不同的貢獻(xiàn)[13-14]。白酒中酒體成分種類及含量構(gòu)成了不同白酒獨(dú)特的風(fēng)味，只有成分種類豐滿、比例協(xié)調(diào)才能形成香氣與口味協(xié)調(diào)，風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)質(zhì)白酒[15]。

表1 優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定結(jié)果Table 1 The results of products in dominant strains fementation

3 結(jié)論

研究以米酒酒曲中3株優(yōu)勢(shì)功能菌根霉菌F1、毛霉菌F2和酵母菌F3為出發(fā)菌株，分別通過單菌和混菌發(fā)酵，檢測(cè)其發(fā)酵過程發(fā)酵液中pH值、還原糖、乙醇含量的變化及發(fā)酵液中酒體成分，進(jìn)一步揭示米酒酒曲中優(yōu)勢(shì)霉菌和酵母菌的發(fā)酵規(guī)律。檢測(cè)結(jié)果顯示，單菌和混菌發(fā)酵過程中pH值變化不大，波動(dòng)在5～7之間；單菌發(fā)酵時(shí)，酵母菌F3殘留還原糖含量較高，但發(fā)酵產(chǎn)乙醇含量最低。混菌發(fā)酵時(shí)，菌株F1和F3的混菌組合殘留還原糖含量較高，菌株F2和F3的混菌組合所產(chǎn)乙醇含量較高。在白酒釀造過程中，微生物間的生長(zhǎng)代謝緊密相關(guān)，隨發(fā)酵的進(jìn)行，微生物會(huì)出現(xiàn)此消彼長(zhǎng)，通過各種復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝，發(fā)酵產(chǎn)物會(huì)不斷發(fā)生變化[16-19]。由F1、F2和F3 3株優(yōu)勢(shì)菌種單菌及混菌發(fā)酵液酒體成分氣相色譜測(cè)定結(jié)果可知，三菌混菌發(fā)酵的酒體成分更豐富，包括了醇、醛、酸及酯四大類，更有利于發(fā)酵生產(chǎn)風(fēng)味佳、品質(zhì)高的米酒。

米酒釀造基本屬于固態(tài)發(fā)酵，在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬米酒酒曲中優(yōu)勢(shì)功能菌的發(fā)酵工藝，可能存在發(fā)酵、菌體生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和代謝產(chǎn)物分泌不均勻的特性，給發(fā)酵參數(shù)的檢測(cè)和控制帶來困難[20]。本試驗(yàn)在盡可能還原米酒固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上對(duì)米酒酒曲中優(yōu)勢(shì)功能菌單菌和混菌發(fā)酵相關(guān)參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果顯示米酒酒曲中優(yōu)勢(shì)菌種在單獨(dú)發(fā)酵和多菌種共發(fā)酵情況下發(fā)酵特性不盡一致，混菌發(fā)酵時(shí)菌種間會(huì)在生長(zhǎng)代謝等方面有抑制或促進(jìn)的相互作用，甚至?xí)淖兙N的代謝途徑進(jìn)而影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量及成分，這對(duì)米酒生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義，可為米酒釀造工藝的優(yōu)化提供參考依據(jù)。