新型離子液體親和萃取雞蛋清中的溶菌酶

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(北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048)

溶菌酶(Lysozyme)是英國(guó)科學(xué)家Fleming于1922年在人的眼淚和唾液中發(fā)現(xiàn)的一種能夠特異性水解微生物細(xì)胞壁的β-1,4糖苷鍵的酶,又稱胞壁質(zhì)酶、細(xì)胞壁溶解酶[1],廣泛存在于鳥(niǎo)類、蛋清、人及其他哺乳動(dòng)物的一些組織細(xì)胞中,其中對(duì)蛋清中溶菌酶的研究最為深入[2-3]。雞蛋清中的溶菌酶是白色、呈晶體結(jié)構(gòu)的粉末,易溶于水,含量占蛋清蛋白總量的3.4%～3.5%,分子量為14.3 kDa,等電點(diǎn)為11.0,最適pH在7.0左右。由于溶菌酶具有無(wú)毒無(wú)害、安全性高、能夠溶解細(xì)胞壁等優(yōu)點(diǎn),并廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、畜牧飼料、醫(yī)藥、生物技術(shù)等領(lǐng)域[4-7],工業(yè)中溶菌酶主要來(lái)源于蛋清,因此蛋清中溶菌酶提取分離至關(guān)重要。

從雞蛋清中提取溶菌酶方法已有很多[8-11],主要有直接結(jié)晶法[12]、離子交換法[13]、超濾法[14]、反膠團(tuán)萃取法[15]、親和色譜法[16]、雙水相逆流色譜法[17]等。但是這些方法得到的溶菌酶純度最高80%,酶活力從10000～17500 U/mg不等,其中結(jié)晶法最簡(jiǎn)單,但是周期長(zhǎng)、效率低、純度和活性低。已經(jīng)工業(yè)化的離子交換法得到的酶活僅為15000 U/mg左右[18-20],親和色譜法可以得到的酶活也僅大于17500 U/mg的酶[21]。離子液體(Ionic liquids,ILs)是一種在室溫或室溫附近呈液態(tài)的熔融鹽,離子液體是一種很好的綠色溶劑,具有蒸氣壓低、良好的熱穩(wěn)定性與化學(xué)穩(wěn)定性、可調(diào)性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),且不同的離子液體對(duì)不同的物質(zhì)溶解性不同[22-24]。但單獨(dú)使用離子液體存在粘度大、萃取物質(zhì)時(shí)間長(zhǎng),且離子液體價(jià)格昂貴等缺點(diǎn),因此將離子液體與其他萃取體系相結(jié)合,既能利用離子液體綠色的優(yōu)勢(shì),又能克服傳統(tǒng)萃取體系的缺點(diǎn),現(xiàn)已成為人們研究的熱點(diǎn)[25-27]。辛巴藍(lán)(Cibacron Blue F-3GA,簡(jiǎn)稱CB)是一種活性染料,分子內(nèi)含有三嗪環(huán)。CB結(jié)構(gòu)中的生色團(tuán)可以與許多蛋白質(zhì)發(fā)生親和作用,活性三聚氯氰官能團(tuán)含氯原子,氯原子能夠與含有羥基、氨基的物質(zhì)發(fā)生取代反應(yīng),因此可以利用這個(gè)性質(zhì)將辛巴藍(lán)與多糖等載體結(jié)合形成親和體系,用于對(duì)蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合[28-32]。

本文采用CB修飾離子液體[C4MIM]Cl,得到一種新型離子液體[C4MIM]3[CB],利用[C4MIM]3[CB]與溶菌酶的特異性結(jié)合作用,經(jīng)過(guò)萃取和反萃取,將雞蛋清中的溶菌酶與其他蛋白實(shí)現(xiàn)高效分離,以期分離得到高純度和高酶活力的溶菌酶。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 市售;溶菌酶、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、Cibacron Blue 3G-A(辛巴藍(lán)F3GA) 美國(guó)Sigma公司;[C4MIM]Cl、[C4MIM]PF6上海成捷化學(xué)有限公司;硝酸銀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純)、丙酮(色譜純)、甲醇(色譜純) Thermo Fisher Scientific(賽默飛世爾科技公司);溶壁微球菌(E.C. 3.2.1.17) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

SpectraMax 190酶標(biāo)儀 Molecular Devices公司;PowerPacTMHC電泳儀 Bio-Rad公司;其它儀器 均為常規(guī)儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 [C4MIM]3CB的合成 稱取1 g CB、2.0179 g AgNO3于30 mL去離子水中溶解,室溫下磁力攪拌24 h。離心(3400×g,5 min)移除上清液,藍(lán)色銀鹽沉淀用10 mL的冰水洗滌3次,沉淀用真空干燥(40 ℃)去除水分。將干燥物溶于10 mL乙腈中,加入3倍當(dāng)量的[C4MIM]Cl,40 ℃下攪拌72 h。反應(yīng)液在3400×g下離心5 min,得到含[C4MIM]3CB的乙腈溶液以及AgCl沉淀,將上清液離心濃縮,真空干燥去除乙腈后用丙酮溶解,離心(3400×g,5 min),以除去未參加反應(yīng)的Ag3CB,得到的上清液經(jīng)離心濃縮、真空干燥,得到目標(biāo)物[C4MIM]3CB。

1.2.2 [C4MIM]3CB的[C4MIM]PF6溶液的配制 離子液體的陰離子會(huì)影響其在水相溶液中的溶解度。在以[C4MIM]3CB的[C4MIM]PF6溶液為萃取劑,從水溶液萃取蛋白質(zhì)時(shí),由于二者在水中有一定的溶解度,會(huì)導(dǎo)致[C4MIM]3CB的流失和蛋白質(zhì)的損失。因此,在將離子液體相用于萃取蛋白之前,用等體積的去離子水洗5次使其處于水飽和狀態(tài),以保證更好的蛋白萃取率。

1.2.3 雞蛋清樣品的處理 取新鮮雞蛋,破殼分離蛋清,以不起泡沫為宜,磁力攪拌30 min,使蛋清稠度均勻,用2層脫脂紗布將攪拌均勻的蛋清過(guò)濾于較大的培養(yǎng)皿中,冷凍干燥(-75 ℃,24 h)得到蛋清粉(100 mL蛋清液得到12 g蛋清粉,得率為12%),置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蛋清粉樣品中溶菌酶含量的測(cè)定 采用國(guó)標(biāo)GB/T 25879-2010的方法測(cè)定雞蛋清樣品中溶菌酶的含量[32]。

1.2.4.1 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將已配制好的0.5 mg/mL溶菌酶溶液(0.9%氯化鈉溶液溶解),用0.9%氯化鈉溶液稀釋成不同濃度。以0.9%氯化鈉溶液為參比溶液,在280 nm下測(cè)定吸光度,以溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,線性方程為Y=0.8531X+0.0513,相關(guān)系數(shù)R2=0.9991,線性關(guān)系良好。

1.2.4.2 蛋清粉樣品中溶菌酶含量的測(cè)定 用0.9%氯化鈉溶液溶解蛋清粉樣品配置成一定濃度的溶液,離心取上清液,按照實(shí)驗(yàn)方法在280 nm下測(cè)定吸光度,平行測(cè)定三次,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到雞蛋清粉樣品中溶菌酶的含量為24 mg/g。

1.2.5 蛋白質(zhì)溶液的萃取過(guò)程 5 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液(0.9%氯化鈉溶液溶解)的萃取分為兩個(gè)部分,萃取和反萃取,操作流程圖如圖1所示。取50 mL蛋白溶液和50 mL離子液體相([C4MIM]3CB的[C4MIM]PF6溶液)充分混合振蕩,完成萃取過(guò)程;離心(5000 r/min,10 min)得到的離子液體相,加入50 mL KCl溶液(1 mol/L),進(jìn)行反萃取操作,離心取出水相溶液在280 nm下測(cè)定蛋白濃度,并脫鹽(透析12 h)、濃縮(超濾管濃縮)、冷凍干燥(-75 ℃,24 h)，得到12.5 mg產(chǎn)品。

圖1 蛋白質(zhì)溶液萃取實(shí)驗(yàn)的基本流程Fig.2 Basic process of proteins extraction experiment

1.2.5.1 蛋白質(zhì)溶液pH對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響 用不同pH(3、5、7、9、11)的醋酸-醋酸鈉緩沖液分別溶解3種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),配制成1 mg/mL的溶菌酶、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液,取0.5 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液加入0.5 mL的4 mg/mL[C4MIM]3CB的離子液體相,渦旋振蕩15 min,離心得到離子液體相;在離子液體相中加入0.5 mL pH為7.0、濃度為1.5 mol/L 的KCl溶液進(jìn)行反萃取,振蕩離心取水相,在280 nm下測(cè)蛋白濃度。

1.2.5.2 離子液體相中[C4MIM]3CB濃度對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響 用去離子水溶解溶菌酶(1、2 mg/mL)、卵白蛋白(1 mg/mL)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(1 mg/mL),取0.5 mL蛋白質(zhì)溶液加入0.5 mL不同濃度的[C4MIM]3CB(0、0.5、1、2、4、8、12 mg/mL)離子液體相,渦旋振蕩15 min,離心得到離子液體相;在離子液體相中加入0.5 mL pH為7.0、濃度為1.5 mol/L的KCl溶液進(jìn)行反萃取,振蕩離心取水相,在280 nm下測(cè)蛋白濃度。

1.2.5.3 振蕩時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響 取0.5 mL 2 mg/mL的溶菌酶水溶液,加入0.5 mL的8 mg/mL[C4MIM]3CB離子液體相,渦旋振蕩0.5、1、5、10、15、30 min,離心得到離子液體相;在離子液體相中加入0.5 mL pH為7.0、濃度為1.5 mol/L 的KCl溶液進(jìn)行反萃取,振蕩離心取水相，在280 nm下測(cè)蛋白濃度。

1.2.5.4 KCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響 取0.5 mL的2 mg/mL溶菌酶水溶液,加入0.5 mL的8 mg/mL[C4MIM]3CB離子液體相,渦旋振蕩15 min,離心得到離子液體相;在離子液體相中加入pH為7.0、濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 mol/L 的KCl溶液進(jìn)行反萃取,振蕩離心取水相,在280 nm下測(cè)蛋白濃度。

1.2.5.5 反萃取溶液pH對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響 取0.5 mL的2 mg/mL溶菌酶水溶液,加入0.5 mL的8 mg/mL[C4MIM]3CB離子液體相,渦旋振蕩15 min,離心得到離子液體相;在離子液體相中加入濃度為1.5 mol/L、pH分別為1、3、5、7、9、11的KCl溶液進(jìn)行反萃取,振蕩離心取水相,在280 nm下測(cè)蛋白濃度。

1.2.6 蛋白質(zhì)萃取率的測(cè)定 通過(guò)萃取和反萃取，得到的蛋白質(zhì)溶液的萃取率按公式計(jì)算。

式(1)

式中:Ce為萃取后水相中蛋白質(zhì)溶液的濃度(mg/mL);C為萃取前加入的蛋白質(zhì)的濃度(mg/mL)。其中蛋白質(zhì)溶液濃度由酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)280 nm下測(cè)得。

1.2.7 蛋清粉溶菌酶含量的測(cè)定 配制一系列濃度的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2 mg/mL),按照優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行萃取和反萃取,以溶菌酶濃度為橫坐標(biāo),反萃取得到的水相中溶菌酶的吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取5 mg/mL蛋清粉樣品水溶液,按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法,進(jìn)行萃取和反萃取,通過(guò)反萃取得到的水相中溶菌酶的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算蛋清粉溶菌酶的含量。

1.2.8 蛋清粉樣品的放大分離實(shí)驗(yàn) 取5 mL的50 mg/mL的蛋清粉樣品,加入5 mL的8 mg/mL[C4MIM]3CB的離子液體相,經(jīng)過(guò)萃取與反萃取,平行兩次,對(duì)萃取后的上清液除鹽、濃縮,并進(jìn)行濃度、純度以及活性測(cè)定。

1.2.9 溶菌酶純度的測(cè)定 利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行蛋白純度的測(cè)定。配制12%分離膠和4%的濃縮膠。吸取30 μL樣品溶液,加入10 μL 4×蛋白上樣緩沖液,混合均勻取10 μL作為電泳樣品。在1×Tris緩沖液中進(jìn)行分離。用考馬斯亮藍(lán)染液R250染色、脫色液脫色,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.2.10 溶菌酶活性的測(cè)定 溶菌酶活性的測(cè)定采用比濁法[33]。用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)液體培養(yǎng)基的pH至7.0,高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min)。將100 μL溶壁微球菌菌液接種于液體培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫?fù)u床中250 r/min培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)好的溶壁微球菌的菌懸液在6000 r/min下離心10 min,棄上清液。用pH6.24的磷酸鹽緩沖液溶解菌體沉淀,在450 nm下測(cè)定吸光度,吸光度落在0.7～0.8為宜。向比色皿中加入0.02 mL樣品溶液、2.98 mL菌液,在450 nm下每min記錄讀數(shù),平行3次。

溶菌酶活力單位的規(guī)定:在450 nm下,每分鐘使溶壁微球菌菌液吸光度降低0.001的酶量,稱為1個(gè)酶活力單位。同時(shí)計(jì)算比活力、酶活回收率和純化倍數(shù)。計(jì)算公式如下。

活力(U/mL)=(ΔA/min)/(0.001/min×0.02 mL)。

比活力(U/mg)=U(U/mL)·M(mg/mL)

式中,M代表蛋白質(zhì)濃度,ΔA代表450 nm下吸光度變化值。

酶活回收率(%)=(反萃取后水相中溶菌酶活力/萃取前蛋白溶液溶菌酶活力)×100;

純化倍數(shù)=反萃取后水相中溶菌酶的比活力/萃取前蛋白稀釋液溶菌酶比活力。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用AutoDock Vina軟件計(jì)算[C4MIM]3CB中[C4MIM]+和CB部分與溶菌酶、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合能。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)溶液pH對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響

由于不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn),因此,pH對(duì)蛋白質(zhì)的萃取有很大影響。在雞蛋清中,卵白蛋白的等電點(diǎn)為4.8,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的等電點(diǎn)6.5,溶菌酶的等電點(diǎn)為11.0[35],三種蛋白的等電點(diǎn)有較大差異,因此實(shí)驗(yàn)考察了不同pH對(duì)三種蛋白質(zhì)萃取率的影響,結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明,在所研究的pH范圍內(nèi),溶菌酶的萃取率明顯高于卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的萃取率,說(shuō)明[C4MIM]3CB與溶菌酶、卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合有明顯差異。

圖2 蛋白質(zhì)溶液的pH對(duì)溶菌酶萃取率的影響Fig.2 Effect of pH of proteins solution on the extraction efficiency of lysozyme

在pH3～11范圍內(nèi),對(duì)于卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,高于兩者等電點(diǎn)時(shí),帶負(fù)電荷,與帶負(fù)電荷的CB部分有排斥作用,但結(jié)果表明兩者與[C4MIM]3CB有一定結(jié)合;低于等電點(diǎn)時(shí),帶正電荷,與CB有靜電相互作用,但結(jié)合不強(qiáng),可能是由于其結(jié)合靜電相互作用并不是關(guān)鍵因素[36]。對(duì)于溶菌酶,所研究的pH低于溶菌酶的等電點(diǎn),溶菌酶帶正電荷,而離子液體[C4MIM]3CB與溶菌酶有親和作用的染料CB部分帶負(fù)電荷,與溶菌酶有靜電相互作用,且CB有疏水性的芳環(huán)結(jié)構(gòu),與溶菌酶的疏水部分有疏水相互作用,因此,在靜電相互作用與疏水相互作用下,溶菌酶與[C4MIM]3CB能夠結(jié)合在一起。由圖3可知,隨著pH的增大,溶菌酶經(jīng)過(guò)萃取和反萃取之后所得的萃取率增加,在pH達(dá)到7左右,溶菌酶被完全萃取出來(lái)。pH低于5時(shí),溶菌酶與[C4MIM]3CB、[C4MIM]PF6可能發(fā)生強(qiáng)靜電相互作用形成締合體,導(dǎo)致溶菌酶變性,影響其溶解度,造成萃取率降低[34]。綜合考慮,選擇pH7.0作為蛋白質(zhì)溶液的pH。為操作方便,選用去離子水(pH=6.8)作為溶解蛋白的溶劑,對(duì)溶菌酶、卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的萃取率分別為98.7%、0.21%、1.74%,能夠達(dá)到將溶菌酶與卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離的目的。

圖3 [C4MIM]3CB在[C4MIM]PF6中的濃度對(duì)溶菌酶萃取率的影響Fig.3 Effect of concentration of[C4MIM]3CB in[C4MIM]PF6 on the extraction efficiency of lysozyme

2.2 [C4MIM]3CB濃度對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響

由圖3可知,溶菌酶的萃取率遠(yuǎn)高于卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的萃取率。對(duì)于同一濃度的溶菌酶,隨著[C4MIM]3CB的濃度增加,溶菌酶的萃取率逐漸增加,當(dāng)濃度不低于8 mg/mL時(shí),萃取率高于98%。對(duì)于卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,由于[C4MIM]3CB與卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白沒(méi)有親和作用,在萃取的過(guò)程中,這兩種蛋白仍留在水溶液中,從而與溶菌酶分開(kāi)。綜合考慮,選擇8 mg/mL的離子液體相、2 mg/mL的溶菌酶作為后續(xù)的研究。由于在萃取過(guò)程中,卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白留在水相中,因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)僅需研究對(duì)溶菌酶的萃取效果。

2.3 振蕩時(shí)間對(duì)溶菌酶萃取率的影響

由圖4可知,隨著萃取時(shí)間的增加,溶菌酶的萃取率增加,這是由于時(shí)間越長(zhǎng),溶菌酶和[C4MIM]3CB的結(jié)合就越完全,在5 min達(dá)到了96.5%,15 min溶菌酶萃取完全,因此選擇15 min作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和蛋白樣品的前萃取時(shí)間。

圖4 振蕩時(shí)間對(duì)溶菌酶萃取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction efficiency of lysozyme

2.4 KCl濃度對(duì)溶菌酶萃取率的影響

溶液的離子強(qiáng)度會(huì)影響蛋白的雙電層厚度。雙電層厚度會(huì)隨著離子強(qiáng)度即鹽溶液濃度的增大而降低,從而使靜電相互作用降低,減弱蛋白質(zhì)與[C4MIM]3CB的結(jié)合作用。因此,可以通過(guò)增加溶液的鹽濃度的方式實(shí)現(xiàn)溶菌酶從離子液體相到水相的反萃取。實(shí)驗(yàn)選用不同濃度的KCl溶液對(duì)萃取后得到的離子液體相進(jìn)行反萃取,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,隨著KCl濃度的增加,將離子液體相中溶菌酶萃取出的量增多,當(dāng)濃度達(dá)到1.5 mol/L時(shí),溶菌酶被完全萃取出來(lái),這是由于隨著KCl濃度的增加,溶液中離子強(qiáng)度增加,蛋白質(zhì)的雙電層厚度變低,與[C4MIM]3CB的CB部分結(jié)合越弱,就越容易萃取到KCl溶液中[36]。因此,選擇KCl濃度為1.5 mol/L作為后萃取的鹽濃度。

圖5 KCl濃度對(duì)溶菌酶萃取率的影響Fig.5 Effect of concentration of KCl on the extraction efficiency of lysozyme

2.5 反萃取溶液pH對(duì)溶菌酶萃取率的影響

pH是影響萃取率的重要因素,因此,需要對(duì)反萃取的KCl溶液的pH進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,隨著pH的增加,溶菌酶的萃取率逐漸增加,在pH7.0時(shí)達(dá)到最大,當(dāng)溶液呈堿性時(shí),溶菌酶的萃取率下降,這可能是由于溶菌酶的等電點(diǎn)為11.0,在接近等電點(diǎn)的附近,溶菌酶的溶解性降低。因此,選擇pH7.0作為反萃取溶液的pH。

圖6 KCl溶液pH對(duì)溶菌酶萃取率的影響Fig.6 Effect of pH of KCl on the extraction efficiency of lysozyme

2.6 蛋清粉樣品的放大分離實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表1所示。由表1可知,5 mL 50 mg/mL的雞蛋清粉經(jīng)過(guò)萃取與反萃取,所得蛋白質(zhì)溶液脫鹽、濃縮、冷凍干燥后,得到了12.3 mg、純度為97.56%的溶菌酶樣品,回收率為92.31%,且經(jīng)過(guò)萃取、反萃取之后,所得溶菌酶的比活力能夠達(dá)到35000 U/mg,與蛋清粉的比活力936 U/mg相比,純化倍數(shù)達(dá)到37.39倍,酶活回收率為89.74%。經(jīng)過(guò)萃取、反萃取之后的水相蛋白質(zhì)溶液的電泳圖如圖7所示。通過(guò)電泳圖可以得出,采用上述萃取方法,在優(yōu)化的萃取條件下,經(jīng)過(guò)萃取步驟后,卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白等其他蛋白被完全去除,經(jīng)反萃取之后能夠得到高純度的溶菌酶。說(shuō)明此方法可以用于蛋清中溶菌酶的分離,分離徹底且能夠保持較高的酶活。

表1 雞蛋清樣品放大萃取結(jié)果Table 1 The amplified extraction results of egg white

圖7 雞蛋清萃取得到的溶液SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE electrophoretic diagram of solution extracted from the egg white 注:1.溶菌酶標(biāo)品;2.卵白蛋白標(biāo)品; 3.卵轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)品;4.萃取后剩余的蛋白質(zhì)溶液; 5.反萃取得到的溶菌酶溶液;6.蛋清樣品。

2.7 AutoDock Vina分析[C4MIM]3CB與蛋白的結(jié)合能

表2 [C4MIM]+和CB分別與溶菌酶、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合能Table 2 The binding energies of[C4MIM]+and CB respectively bindto lysozyme, ovalbumin and ovotransferrin respectively

圖8 溶菌酶與[C4MIM]3CB結(jié)合圖Fig.8 Conmbination graph of lysozyme and[C4MIM]3CB

圖9 卵白蛋白與[C4MIM]3CB結(jié)合圖Fig.9 Conmbination graph of albumin and[C4MIM]3CB

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立并優(yōu)化了一種利用CB修飾的新型離子液體[C4MIM]3CB高效萃取雞蛋清中溶菌酶的方法,并利用蛋白結(jié)構(gòu)模型,計(jì)算其與[C4MIM]3CB的結(jié)合能,對(duì)其可能的分離機(jī)理進(jìn)行了探討。優(yōu)化的最佳萃取分離條件為：蛋清粉溶液pH7,新型離子液體中[C4MIM]3[CB]濃度為8 mg/mL，反應(yīng)震蕩時(shí)間為15 min,反萃取KCl溶液pH7.0,濃度為1.5 mol/L，最終250 mg蛋清粉可得12.3 mg溶菌酶產(chǎn)品。該方法經(jīng)過(guò)萃取和反萃取兩步過(guò)程,實(shí)現(xiàn)了溶菌酶與蛋清中其他蛋白的完全分離,得到高純度(97.56%)、高活性(35000 U/mg)的溶菌酶。與其它已有的萃取分離方法相比(其溶菌酶最高純度80%,最高活性17500 U/mg),此法具有選擇性高、操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)品純度高等特點(diǎn),為蛋清中溶菌酶的提取分離提供了一條新的、高效的途徑。