腎康注射液抑制體外培養(yǎng)小鼠腹膜間皮細胞中TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的釋放

王荔，夏天△，張洪震，李榮

我國成年人群中慢性腎臟病的患病率為10.8%［1］，終末期腎?。‥SRD）患者中約有15%選擇腹膜透析（PD）替代治療，且這一比例在逐年增加。由于腹透液的生物不相容性，長期PD容易發(fā)生腹膜纖維化（PF）并最終致超濾衰竭，使患者被迫退出治療［2］。因此，采取有效策略保護腹膜間皮細胞（PMCs）、延緩腹膜纖維化進程、維持有效超濾是保證PD患者長期成功透析的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，許多益氣活血、健脾補腎的中藥都有抗炎、抗纖維化的作用，可防止或延緩PF［3］。腎康注射液由大黃、黃芪、丹參、紅花組方，具有降逆泄?jié)?、益氣活血、通腑利濕的功效。本研究通過體外實驗探討腎康注射液對高糖誘導的小鼠PMCs中腫瘤壞死因子（TNF）-α、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）等細胞因子的影響及保護PMCs的機制，為其應(yīng)用于PD相關(guān)PF的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 小鼠PMCs（北京藍夢生物科技股份有限公司）；腎康注射液（國藥準字Z20040110，西安世紀盛康藥業(yè)有限公司）；TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA，武漢博士德生物工程有限公司）及免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、EDTA、胎牛血清（天津易生源生物科技有限公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco），超純RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-time PCR試劑盒（TaKaRa），相關(guān)引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞傳代培養(yǎng) 參照文獻［4］，將購置的小鼠PMCs棄去原有培養(yǎng)液，以PBS（pH=7.4）沖洗細胞2次；向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入3 mL消化液（0.25%胰蛋白酶+0.016%EDTA）；于37℃培養(yǎng)箱中孵育5～10 min，棄去消化液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL終止消化；輕輕吹打至細胞完全自瓶壁脫離；將細胞懸液移入離心管，1 000 r/min離心10 min；棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液（DMEM低糖型+10%胎牛血清+200 U/mL青霉素+200 U/mL鏈霉素）重懸細胞，取約4×104個細胞接種于新的培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 PMCs的鑒定 參照文獻［4］，采用免疫細胞化學染色的方法，分別進行角蛋白及白細胞CD45抗原染色，光鏡下定性觀察。

1.2.3 分組及干預(yù) 實驗分為5組：空白對照組（A組，只加DMEM）；陽性對照組（B組，DMEM+140 mmol/L葡萄糖）；低劑量腎康干預(yù)組（C組，在B組的基礎(chǔ)上添加體積比1%的腎康注射液）；中劑量腎康干預(yù)組（D組，在B組的基礎(chǔ)上添加體積比2%的腎康注射液）；高劑量腎康干預(yù)組（E組，在B組的基礎(chǔ)上添加體積比4%的腎康注射液）。小鼠PMCs經(jīng)傳代培養(yǎng)融合后，消化，傳代至第3～4代，分別給予新鮮培養(yǎng)液（按分組情況添加高濃度葡萄糖或不同濃度腎康注射液），培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察，分別收集細胞和培養(yǎng)上清液，凍存以備檢測。

1.2.4 ELISA法檢測細胞因子含量 準備待測樣品（細胞培養(yǎng)上清液）及標準品加入96孔板，添加生物素標記二抗和酶標試劑，37℃反應(yīng)60 min，洗板3次，加入顯色劑A、B，37℃顯色10 min，加入終止液，10 min內(nèi)酶標儀測光密度（OD450）值，帶入標準曲線，計算出樣品中TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的濃度。

1.2.5 Real-time RT-PCR檢測細胞因子的mRNA水平 取凍存于液氮中小鼠PMCs，按試劑盒操作步驟提取總RNA，測定RNA純度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再進行PCR擴增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix Ex Taq12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，cDNA模板2μL，加ddH2O至總體系25μL。擴增條件：95℃30 s；95℃ 5 s，60℃34 s，30個循環(huán)。將各樣品cDNA稀釋10倍后取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因（Actin）引物進行擴增，每組重復(fù)8次，在60～95℃進行熔解曲線分析。采取2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

Tab.1 Primer sequences and amplified fragment length表1 引物序列及擴增片段長度

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析；以Levene法進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用LSD-t法，若方差不齊，采用Games-Howell法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠PMCs鑒定結(jié)果 細胞傳代培養(yǎng)24 h后開始單層貼壁生長，光鏡下見細胞呈多邊形，生長融合后呈鋪路石狀排列，具有典型上皮細胞形態(tài)，見圖1。細胞生長近融合前加入高濃度葡萄糖和不同濃度腎康注射液培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察，小鼠PMCs狀態(tài)良好，生長沒有受到明顯影響，見圖1A、B。細胞免疫組化光鏡下觀察，所培養(yǎng)的細胞具有PMCs特征，呈角蛋白陽性、白細胞抗原CD45陰性，見圖1C、D。

Fig.1 Cultured mouse PMCs in vitro and cellular IHC staining results圖1 體外培養(yǎng)的小鼠腹膜間皮細胞及細胞免疫組化

2.2 各組MPMCs培養(yǎng)上清液中細胞因子水平比較 與A組比較，B～E組TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF均升高（P＜0.05），與B組比較，除C組VEGF和 CTGF外，各實驗組 TNF-α、TGF-β1、VEGF及CTGF表達水平均顯著降低（P＜0.05），且隨著腎康濃度的升高，上述細胞因子的表達水平呈下降的趨勢，見表2。

Tab.2 Four kinds of cytokines levels in the culture supernatant fluid of five groups表2 5組小鼠PMCs培養(yǎng)上清液中4種細胞因子的水平（n=8，ng/L，±s）

Tab.2 Four kinds of cytokines levels in the culture supernatant fluid of five groups表2 5組小鼠PMCs培養(yǎng)上清液中4種細胞因子的水平（n=8，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；A：空白對照組；B：陽性對照組；C：低劑量腎康干預(yù)組；D：中劑量腎康干預(yù)組；E：高劑量腎康干預(yù)組；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與d組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組E組F TNF-α 96.9±12.3 238.8±21.4a 167.9±13.6ab 161.1±20.7ab 132.1±17.4abcd 72.236＊＊TGF-β1 50.6±11.1 139.8±13.4a 124.7±11.3ab 111.6±8.4abc 97.7±12.3abcd 71.443＊＊VEGF 79.4±12.3 152.7±18.8a 139.7±12.3a 133.7±12.5ab 115.2±14.1abcd 32.054＊＊CTGF 85.6±9.0 168.9±24.9a 157.2±17.0a 145.6±15.4ab 131.1±16.9abc 27.582＊＊

2.3 各組小鼠 PMCs中 TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較 與A組比較，B～E組TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF mRNA水平均不同程度升高（P＜0.05）；與B組比較，C～E組各因子mRNA水平均下降（P＜0.05）；各組間各指標兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

Tab.3 mRNA relative transcription levels of 4 kinds of cytokines in cultured mouse PMCs表3 5組小鼠PMCs中4種細胞因子的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平 （n=8，±s）

Tab.3 mRNA relative transcription levels of 4 kinds of cytokines in cultured mouse PMCs表3 5組小鼠PMCs中4種細胞因子的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；A：空白對照組；B：陽性對照組；C：低劑量腎康干預(yù)組；D：中劑量腎康干預(yù)組；E：高劑量腎康干預(yù)組；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與D組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組E組F TNF-α 1.002±0.007 1.805±0.062a 1.537±0.051ab 1.443±0.051abc 1.300±0.029abcd 358.366＊＊TGF-β1 1.001±0.006 1.926±0.055a 1.603±0.059ab 1.506±0.035abc 1.413±0.035abcd 500.124＊＊VEGF 1.001±0.004 1.909±0.009a 1.609±0.024ab 1.497±0.039abc 1.440±0.032abcd 1310.114＊＊CTGF 1.001±0.004 1.935±0.027a 1.581±0.041ab 1.494±0.037abc 1.452±0.037abcd 878.687＊＊

3 討論

PF是長期腹膜透析患者面臨的問題，目前臨床常采用藥物干預(yù)、改進腹透技術(shù)、規(guī)范操作、預(yù)防感染、改善腹膜透析液的生物相容性等防治策略，近年來也開展了相關(guān)的基因治療［5］。許多中藥具有抗炎、抗纖維化的作用，被用于慢性腎臟病的治療。中藥對腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的防治備受關(guān)注。大黃的有效成分是大黃酸、大黃素等蒽醌衍生物。大黃素可抑制蛋白激酶通路的激活和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的磷酸化，減少高糖誘導的PMCs中TGF-β1的分泌，從而防治高糖誘導的腹膜結(jié)構(gòu)和功能異常［6］。大黃酸具有抗氧化作用，一定濃度下可保護血管內(nèi)皮細胞且無顯著細胞毒性［7］。既往已有研究發(fā)現(xiàn)，以大黃為君藥的腎康注射液可改善透析液誘導的腹膜功能減退和抑制氧化應(yīng)激［8］。

腹透液的生物不相容性、腹膜炎或其他微炎癥狀態(tài)是腹膜纖維化的主要原因。腹膜纖維化時，纖維結(jié)締組織增生，腹膜增厚，間皮細胞腫脹、變形、脫落，細胞間隙增寬，炎性細胞浸潤，新生血管形成。間皮下基質(zhì)和血管壁發(fā)生改變，影響腹膜轉(zhuǎn)運功能，最終導致超濾失敗。TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF均是目前公認的在腹膜纖維化中起重要作用的細胞因子。TNF-α是一種炎性細胞因子，在腹膜纖維化過程中發(fā)揮著重要的作用［9］。腹透液的生物不相容性導致的無菌性炎癥、缺氧和炎癥狀態(tài)可促進其表達及釋放，并促進VEGF、IVAM-1、血管緊張素Ⅱ、IL-6和IL-8的表達。這些細胞因子激活纖維母細胞、肌纖維母細胞和內(nèi)皮細胞，激活缺氧誘導因子（HIF-1α）通路，導致血管生長和纖維母細胞增生，最終導致腹膜纖維化［10］。目前認為，腹膜間皮細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腹膜纖維化的起點，并促進腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展，TGF-β1是整個過程的中心環(huán)節(jié)［11-12］，參與組織纖維化的整個進程。VEGF可促進全身各組織器官血管內(nèi)皮細胞的生長、增殖，而血管生成和炎癥正是腹膜纖維化發(fā)病機制的兩條主線［13］。一方面，VEGF促進內(nèi)皮增生和新生血管形成，增加了腹膜透析液體交換的有效面積。另一方面，腹膜血管的擴增和通透性的改變會增加小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運，最終使腹膜超濾功能受損。VEGF可促進腹膜組織糖尿病樣微血管改變，加重腹膜組織的缺血性損傷，促進腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展。而使用抑制血管形成的藥物內(nèi)皮抑素肽可抑制VEGF的表達，減少纖維組織的增生，從而改善腹膜纖維化的進程［14］。CTGF是CCN家族成員，其過表達與增生性或纖維化性疾病密切相關(guān)，是許多致纖維化因子作用的共同介質(zhì)，也是VEGF、TGF-β1重要的下游效應(yīng)分子，介導了它們的致纖維化效應(yīng)［15］。前期筆者的研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的腎康注射液可通過抑制 CAPD 小鼠 PMCs的 TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的表達，保護PMCs，從而控制腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展［16］。

本研究通過體外細胞培養(yǎng)，觀察腎康注射液對高濃度葡萄糖誘導的TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的表達的影響。小鼠PMCs為上皮來源，貼壁生長，本研究選擇低糖型（低于1.0 g/L）DMEM作為培養(yǎng)液，不加任何處理為空白對照組。目前認為高濃度葡萄糖可誘導細胞因子的釋放，刺激PMCs基質(zhì)增生和間皮細胞凋亡脫落，促進腹膜纖維化的發(fā)生［17-18］。按照2.5%腹膜透析液中葡萄糖濃度計算，并參考文獻［19］中細胞能夠耐受的葡萄糖濃度，選擇DMEM+140 mmol/L葡萄糖作為陽性對照。實驗組細胞培養(yǎng)液中再分別加入不同濃度的腎康注射液。結(jié)果顯示：與空白對照組比較，高糖可誘導TNF-α、TGF-β 1、VEGF、CTGF等細胞因子水平的顯著升高（P＜0.05），當細胞培養(yǎng)液中加入腎康注射液后，由高糖誘導的TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF等細胞因子水平較陽性對照組均有不同程度下降。另外，與空白對照組比較，高糖可誘導這4種細胞因子的mRNA表達顯著升高，當加入腎康注射液后，各細胞因子mRNA水平仍有升高，但與陽性對照組比較，呈逐漸降低趨勢。結(jié)合對蛋白質(zhì)水平的影響，筆者推測腎康注射液可以抑制體外培養(yǎng)小鼠PMCs與腹膜纖維化密切相關(guān)的細胞因子TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的釋放，并以劑量或濃度依賴的方式，通過抑制由高糖誘導的小鼠 PMCs中 TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的表達和轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)對小鼠PMCs的保護。

腎康注射液標本兼顧，以祛邪為主，活血扶正為輔，組方科學合理。關(guān)于其抑制PMCs TGF-β1、CTGF等致纖維化細胞因子的表達和轉(zhuǎn)錄的機制尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，由于炎癥和血管生成導致腹膜纖維化的主要分子機制可能與包括Toll樣受體-配體介導、NOD-樣受體蛋白3/IL-1β、VEGF以及血管生成素2/Tie2信號通路有關(guān)［13］。研究還發(fā)現(xiàn)，對誘導腹膜纖維化和隨后的腹膜功能失調(diào)起重要作用的EMT主要由TGF-β1家族成員以及Toll樣/IL-1β受體傳遞信號［20］。腎康注射液是通過其中的哪個或哪些途徑對腹膜功能進行保護，從而抑制腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展尚不明確，關(guān)于機制的研究今后仍需進一步深入探索，以期為腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的防治提供理論基礎(chǔ)。