孫俊麗，廖海洪，張 冰，孫如玉，盧克煥，盧晟盛

(1.廣西大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,廣西 南寧 530004； 2. 廣西畜牧研究所 家畜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530001)

【研究意義】家畜性別鑒定和控制技術(shù)可實(shí)現(xiàn)受性別限制(泌乳、產(chǎn)蛋)或者影響(毛皮、肉質(zhì)、生長(zhǎng)速度)生產(chǎn)性狀后代的選擇，增加選種強(qiáng)度，加速遺傳改良進(jìn)程，提高產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益最大化[1]，與超數(shù)排卵、活體采卵、體外受精、胚胎體外培養(yǎng)及胚胎分割等技術(shù)聯(lián)合使用，必將對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展做出更大貢獻(xiàn)。在野生動(dòng)物保護(hù)和利用方面，可通過(guò)鑒定野生動(dòng)物的殘留物(糞便、毛發(fā)等)中的DNA，了解野生動(dòng)物的種群數(shù)量和性別比例，為野生動(dòng)物的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】性別鑒定技術(shù)是實(shí)現(xiàn)后代性別控制的主要途徑之一。基于因性別而異的DNA序列的PCR擴(kuò)增法以其特異性強(qiáng)、靈敏、快速、便捷、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到各個(gè)性別鑒定領(lǐng)域，特別是對(duì)腐爛、降解的考古和法醫(yī)樣品[2-4]、微量的胚胎樣[5-6]和游離DNA樣[7-9]等鑒定中，展現(xiàn)出其較高的應(yīng)用價(jià)值。以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的性別鑒定，目的基因的選擇是關(guān)鍵，最初多選擇Y染色體上特有基因，如雄性性別決定基因(SRY)、Y染色體上的重復(fù)序列等，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)判定，一旦基因擴(kuò)增失敗，出現(xiàn)假陰性結(jié)果[10-13]。因此，需另外設(shè)計(jì)1對(duì)常染色體基因引物作為內(nèi)參，提高判定的準(zhǔn)確率，但多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增易產(chǎn)生引物二聚體，給PCR反應(yīng)條件優(yōu)化帶來(lái)一定的困難。隨后，X、Y染色體上的同源基因—鋅指蛋白基因(ZFx/ZFy)[14]和牙釉質(zhì)基因(AMELx/AMELy)序列差異的發(fā)現(xiàn)，一對(duì)引物即可實(shí)現(xiàn)性別的準(zhǔn)確鑒定，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于部分動(dòng)物的性別鑒定[15-20]。但是，常規(guī)PCR擴(kuò)增對(duì)模板濃度有一定要求，微量樣品(如胚胎活檢、游離DNA)的鑒定則存在一定的難度，而巢式PCR擴(kuò)增的出現(xiàn)解決了這一困境?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近幾十年來(lái)，因新的生殖技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)力顯著提升。而針對(duì)豬胚胎性別鑒定的文獻(xiàn)卻很少，大部分則集中在Y染色體特異基因[21-22]，僅有少數(shù)針對(duì)AMEL基因的報(bào)道，且均采用的是常規(guī)PCR[23-24]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】根據(jù)豬AMELx和AMELy序列的比對(duì)，設(shè)計(jì)了2對(duì)引物經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增鑒定豬ICSI早期囊胚的性別，為豬胚胎活檢或者微量DNA樣品的性別鑒定提供一種準(zhǔn)確、可靠的PCR方法，并研究ICSI操作對(duì)胚胎性別發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

供試試劑藥品除特別說(shuō)明外，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；2×PCR mix、蛋白酶K、組織樣基因組提取試劑盒: 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker: 南京生興生物技術(shù)有限公司；TCM-199：Gibco，美國(guó)；FSH、LH：中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)：美國(guó)Hyclone公司。

梯度PCR儀(德國(guó)Biometra公司)，凝膠成像系統(tǒng)AlphaImager HP(美國(guó)Naturegene公司)，可調(diào)式微量移液器、臺(tái)式高速離心機(jī)Centrifuge 5415 D (德國(guó)eppendorf公司)，電泳儀DDY-2C型(北京六一生物科技有限公司)，顯微操作儀、體視顯微鏡(日本Nikon公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoFisher Scientific公司)等等。

1.2 試驗(yàn)材料

10頭豬耳組織樣品采自廣西畜牧研究所試驗(yàn)豬場(chǎng)。豬卵巢采自廣西南寧市石埠屠宰場(chǎng)，置于30～37 ℃含雙抗的生理鹽水中，3 h內(nèi)保溫送回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)豬AMEL基因內(nèi)含子3區(qū)域序列(AMELx，GenBank accession No.：AB091791 ；AMELy，GenBank accession No.：AB091792)，采用BLAST和Clustal W程序設(shè)計(jì)巢式引物。

外引物：

AMEL-Fo: 5＇-AAGCTACCACCTCATCCTG -3＇

AMEL-Ro: 5＇-GCCATCTCATACTTTCCCTTG -3＇

內(nèi)引物：

AMEL-Fi: 5＇-GGTGGATTCTTCATTCAGGATG -3＇

AMEL-Ri: 5＇-AAAGACCAGCGAGGGAGA -3＇

兩對(duì)引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

雌雄PCR產(chǎn)物僅9～10 bp的缺失，在瓊脂糖凝膠中不能被明顯區(qū)分，但可用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分型。而本實(shí)驗(yàn)則是在其內(nèi)引物F5＇端添加6-FAM熒光，用于PCR產(chǎn)物片段掃描分型。

引物合成后，根據(jù)每管OD值加ddH2O調(diào)節(jié)濃度10 pm，漩渦混勻，4 ℃冰箱放置2 h以上，使引物充分溶解。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 豬耳組織的采集和基因組提取 從廣西畜牧研究所試驗(yàn)豬場(chǎng)采集了5頭公豬和5頭母豬的耳組織樣，75 %酒精保存帶回實(shí)驗(yàn)室。按照組織樣基因組提取試劑盒的使用說(shuō)明，提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并參照電泳條帶的亮度將樣品DNA濃度調(diào)整至相似水平。

1.4.2 豬精液前處理 商用17 ℃保存豬鮮精液，取200 μl 液加入2 mL DPBS溶液，1000 r/min，5 min離心洗滌2～3次，再加入1 mL DPBS溶液，置于JT92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行精子斷尾處理，1000 r/min，2 min離心，棄上清，最后將離心好的精子稀釋到106個(gè)/mL 備用[25]。

1.4.3 豬ICSI胚胎生產(chǎn)和培養(yǎng) 按照本課題組長(zhǎng)期使用的豬ICSI胚胎生產(chǎn)流程操作。經(jīng)化學(xué)激活(離子霉素3.5 min和6-DAMP 3.5 h)后，將胚胎移入已平衡4 h時(shí)以上的PZM-3溶液中清洗，再放入PZM-3滴，每滴15～20枚胚胎，置于38.5 ℃，5 % CO2和100 %濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.4 常規(guī)PCR擴(kuò)增 以豬基因組DNA樣品為模板，對(duì)巢式內(nèi)、外引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，并優(yōu)化擴(kuò)增條件，反應(yīng)體系(表1)。

PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，X ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。其中外引物的退火溫度為60 ℃，內(nèi)引物的退火溫度為62 ℃，擴(kuò)增的特異性較好。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.4.5 瓊脂糖凝膠電泳分析 取 3 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5 %的瓊脂糖凝膠(含 0.05 μg/mL gelred)，電壓 110 V，電泳時(shí)間 50 min，紫外透射儀觀察擴(kuò)增結(jié)果，在全自動(dòng)數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)上拍照。

1.4.6 豬囊胚的獲得和細(xì)胞裂解 在體視顯微鏡下，吸取單個(gè)囊胚，置于預(yù)先準(zhǔn)備好的ddH2O中清洗2次。體視顯微鏡下將胚胎置于0.2 mL的EP管中，盡量少帶液體，控制在2 μl之內(nèi)。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用廢棄的豬孤雌囊胚優(yōu)化小鼠胚胎裂解方法，使其更有利于豬囊胚裂解。

解凍的胚胎，10 000 r/min離心30 s，加入配置好的裂解液(3 μl天根蛋白酶K+ 2 μl 1 % tween 20 + 2 μl 1 % triton 100 + 3 μl ddH2O，漩渦混勻)1.5 μl，再10 000 r/min離心30 s，室溫放置10 min。然后將裂解胚胎的PCR管放入PCR儀，56 ℃ 15 min ，95 ℃ 5 min，4 ℃ 30 s，完成細(xì)胞DNA徹底釋放。

1.4.7 豬囊胚的巢式PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè) 囊胚裂解后，開(kāi)始巢式第1次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為Primix (天根) 12.5 μl，外引物各0.5 μl，裂解所得DNA 3 μl，ddH2O 8.5 μl，共計(jì)25 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 50 s，25個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃無(wú)窮。繼續(xù)進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為Primix(天根)12.5 μl，內(nèi)引物F、R各0.5 μl，外側(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物 0.5 μl，補(bǔ) ddH2O 至25 μl。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃ 終止。2.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.4.8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段掃描 巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后，送往Thermofisher Scientific(中國(guó))有限公司進(jìn)行片段大小掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組擴(kuò)增

利用豬耳組織基因組DNA驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的AMEL 基因的巢式內(nèi)、外引物，經(jīng)過(guò)摸索確定兩對(duì)引物的最優(yōu)退火溫度，獲得特異性較好的擴(kuò)增結(jié)果(圖1)， 其中，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期大小一致，外引物擴(kuò)增大小約為530 bp，內(nèi)引物擴(kuò)增大小約為170 bp。

1～10 外引物擴(kuò)增條帶；1′～10′為內(nèi)引物擴(kuò)增條帶；M：DL20001-10：Amplified bands on external primers; 1′-10′: Amplified bands on inner primers; M: DL2000圖1 豬基因組AMEL基因內(nèi)、外引物的PCR 擴(kuò)增Fig.1 Porcine genemic DNA sex identification by external primer and inner primer of AMEL gene PCR

圖2 豬胚胎巢式PCR的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Sex determination based on the amplification of porcine AMEL gene by nested PCR

圖3 AMEL基因巢式擴(kuò)增產(chǎn)物的掃描Fig.3 Electropherogram traces obtained on an automatic sequencer

2.2 豬囊胚巢式PCR擴(kuò)增

本試驗(yàn)分多批次共收集了205個(gè)豬ICSI早期囊胚，按照上述的方法對(duì)囊胚進(jìn)行了裂解和巢式PCR擴(kuò)增。結(jié)果特異性擴(kuò)增了199個(gè)ICSI樣品，6個(gè)擴(kuò)增失敗(圖2)。

2.3 巢式PCR片段的掃描

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖檢測(cè)后，做好標(biāo)記。送至Thermofisher Scientific公司進(jìn)行熒光標(biāo)記—半自動(dòng)基因組掃描。根據(jù)目的片段區(qū)域掃描主峰的多少判定胚胎性別，標(biāo)準(zhǔn)如下(圖3)，因雌性胚胎只存在AMELx等位基因，在178～179 bp處出現(xiàn)1個(gè)主峰，而雄性胚胎包含有AMELx和AMELy2個(gè)等位基因，在169～171和178～179 bp處出現(xiàn)了2個(gè)主峰。本試驗(yàn)通過(guò)分析共判定雄性胚胎71個(gè)，雌性胚胎128個(gè)，公母比例1∶1.8，偏離了1∶1。

2.4 雄性胚胎PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序

為驗(yàn)證PCR產(chǎn)物掃描結(jié)果的可靠性，挑選了2個(gè)雄性胚胎的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖 4。上部分是AMELx和AMELy基因序列的比對(duì)圖，下半部分是豬雄性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果圖，并在圖中標(biāo)識(shí)出缺失起始位點(diǎn)和缺失序列，從缺失第1個(gè)位點(diǎn)開(kāi)始，DNA測(cè)序峰圖大部分單堿基位點(diǎn)出現(xiàn)2個(gè)峰。

3 討 論

相對(duì)于其它畜禽物種，豬精液冷凍、胚胎冷凍和體外受精技術(shù)都不是很成熟，特別是體外受精時(shí)，多精受精現(xiàn)象很顯著。加上其手術(shù)法的胚胎移植，限制了豬胚胎體外生產(chǎn)的應(yīng)用，也使得豬胚胎性別鑒定研究較少。以前的研究多是基于SRY基因、AMEL基因和Y染色體上的重復(fù)序列SUSYb的常規(guī)PCR擴(kuò)增，因胚胎細(xì)胞數(shù)較少，循環(huán)數(shù)一般都在40次以上[23]。隨著循環(huán)數(shù)的增加，DNA聚合酶的活性和擴(kuò)增效率明顯降低，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物增加[22, 24, 26]。而巢式PCR則是利用2對(duì)引物經(jīng)2次PCR擴(kuò)增目的片段的方法，第2次擴(kuò)增是以第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，其引物結(jié)合到第1次PCR產(chǎn)物序列的內(nèi)部，再加入Taq酶進(jìn)行再次PCR反應(yīng)，該方法既增加了模板量又保證了Taq酶的活性，如果第1次擴(kuò)增發(fā)生了錯(cuò)誤片段，則第2次能在錯(cuò)誤片段上形成引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率很低，基本上不會(huì)出現(xiàn)非特異性片段。因此巢式PCR的特異性、靈敏度，準(zhǔn)確度都很高。最具有代表性的例子是Colley等[27]對(duì)牛單個(gè)精子進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，可以獲得清晰理想的鑒定結(jié)果。

圖4 豬雄性胚胎AMEL基因的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序Fig.4 Sequence of the production of PCR on AMEL gene of porcine male embryo

牙釉質(zhì)基因(AMEL)是負(fù)責(zé)牙釉質(zhì)發(fā)育的一類(lèi)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族基因，在大部分哺乳動(dòng)物中，該基因位于X染色體(AMELx)和Y染色體(AMELy)上，屬于X、Y同源基因。人、豬、牛、馬、羊、黑熊、狗、鹿等動(dòng)物的AMEL編碼基因在X、Y染色體均有定位，并存在不同程度的堿基缺失，可作為哺乳動(dòng)物性別鑒定的目標(biāo)基因。而在鼠類(lèi)，AMEL基因僅存在于X染色體[31]，單孔類(lèi)、有袋類(lèi)動(dòng)物的AMEL基因則位于常染色體上[32]，因此，AMEL基因不能用來(lái)開(kāi)展這幾類(lèi)動(dòng)物的性別鑒定。雖然已成功利用AMEL基因開(kāi)展了部分動(dòng)物的性別鑒定，但基于AMEL基因的豬性別鑒定，因相差9 bp的缺失，瓊脂糖凝膠不能分型，必須用聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，增加了工作量和成本。本實(shí)驗(yàn)利用巢式PCR擴(kuò)增并結(jié)合熒光標(biāo)記的半自動(dòng)基因組掃描技術(shù)對(duì)相差9 bp缺失的豬AMELX/Y基因進(jìn)行分型，分型的過(guò)程簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高。該方法不失為一種有效的豬微量基因性別鑒定的方法。

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)是借助顯微操作系統(tǒng)將單一精子注射入卵子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并使其受精的一種輔助生殖技術(shù)。從第一例倉(cāng)鼠ICSI后代成功報(bào)道以來(lái)，該技術(shù)已先后被用于兔子、貓、牛、小鼠、羊、馬、豬、猴子和人等動(dòng)物。特別是人類(lèi)，該技術(shù)已成為男性不育的救星被廣泛應(yīng)用。有關(guān)研究證實(shí)，不同哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞對(duì)ICSI操作的應(yīng)答不同[33]。人、小鼠和兔子的ICSI操作足以激活其卵母細(xì)胞，促成精子的去凝聚和雄性原核的形成，而豬和牛的ICSI操作則不能有效地激活卵母細(xì)胞，造成精子去凝聚失敗，需在ICSI之后執(zhí)行額外的激活操作激活卵母細(xì)胞，促進(jìn)雄性原核的形成，這一激活操作不可避免地促成了部分卵母細(xì)胞的孤雌激活。本試驗(yàn)205枚豬ICSI胚胎中，雌性胚胎128枚，雄性胚胎71枚，公母比例1∶1.8，偏離1∶1。說(shuō)明在雌性胚胎中存在部分孤雌胚胎。究其原因有二，一是在保證ICSI胚胎中均被注射單個(gè)精子的情況下，存在部分精子未被有效去凝聚，雄性原核未形成，額外的激活操作造成孤雌胚胎的形成，而PCR性別鑒定方法將孤雌胚胎歸為ICSI雌性胚胎；二是ICSI所用精子注射前處理可能造成精子基因組的損傷，研究證實(shí)，小鼠的卵母細(xì)胞啟動(dòng)發(fā)育后，具有修復(fù)精子DNA損傷的能力[28-30]，但卵母細(xì)胞可以基于自己的X染色體序列修復(fù)精子X(jué)染色體上基因的損傷，卻無(wú)法修復(fù)Y精子染色體上的基因損傷，有可能造成Y ICSI胚胎比例下降。這需要探求一些新的方法去區(qū)分雌性胚胎和孤雌胚胎，及完善精子前處理方法，確保ICSI胚胎性別鑒定的準(zhǔn)確性和維持正常的性別比例。

4 結(jié) 論

基于豬AMELx、AMELy基因內(nèi)含子3中9～10 bp的序列缺失，利用巢式PCR方法—熒光標(biāo)記半自動(dòng)基因掃描技術(shù)鑒定豬胚胎性別是可行的。