夏金嬋

（河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046）

一氧化氮（Nitric oxide，NO）參與植物的許多脅迫反應(yīng)過程，是一個(gè)重要的信號(hào)分子，NO可通過翻譯后修飾改變蛋白或酶的活性及功能，主要的調(diào)控形式是NO與半胱氨酸上的硫基發(fā)生可逆的S-亞硝基化作用，NO還可對(duì)金屬蛋白的金屬中心進(jìn)行亞硝基化，或者與蛋白的酪氨酸殘基結(jié)合發(fā)生不可逆的硝化作用。NO屬于活性氮分子（Reactive nitrogen species，RNS），其半衰期很短，這限制了它在細(xì)胞中的生理功能。胞內(nèi)含硫基的分子能夠與NO相互作用，形成S-亞硝基硫醇（S-nitrosothiols，SNO），其也屬于RNS，但是比NO的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在植物的生長發(fā)育及抗逆過程中SNOs參與NO的運(yùn)輸、擴(kuò)散、儲(chǔ)存以及蛋白的翻譯后修飾過程［1］。NO及RNS能夠與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）在有氧條件下發(fā)生S-亞硝基化作用形成S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO），GSNO是一個(gè)穩(wěn)定的NO儲(chǔ)存庫和轉(zhuǎn)運(yùn)形式［2］。

乙醇脫氫酶Ⅲ（Alcohol dehydrogenase Ⅲ，ADH3）普遍存在于真核與原核生物，而且高度保守，參與甲醛的解毒過程（甲醛+谷胱甘肽+NAD+S-甲酰谷胱甘肽+NADH+H+），而且該酶還催化依賴NADH的S-亞硝基谷胱甘肽還原成氧化型的谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）和NH3的過程［3］，該過程也可被看作是一個(gè)亞硝基化作用，影響GSNO的水平，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)NO的含量。在植物和其他生物中亞硝基谷胱甘肽還原酶（S-nitrosoglutathione reductase，GSNOR）最初被認(rèn)定為是一個(gè)依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶，后來發(fā)現(xiàn)催化反應(yīng)過程包含S-亞硝基谷胱甘肽羥基的氧化，以及谷胱甘肽與甲醛形成S-甲?；入赘孰?。因此，重新命名為S-亞硝基谷胱甘肽還原酶，該酶參與S-亞硝基硫醇的代謝過程。GSNOR在進(jìn)化過程中相當(dāng)保守，在保護(hù)細(xì)胞免受硝化脅迫中起作用，GSNOR屬于乙醇脫氫酶Ⅲ家族，同源二聚體，每個(gè)亞單位含有兩個(gè)鋅原子，NH3和GSSG是GSNOR催化的產(chǎn)物［4］，GSNOR以把NO轉(zhuǎn)移到特定的蛋白上，使蛋白發(fā)生亞硝基化，調(diào)控GSNO與蛋白亞硝基化之間的平衡，穩(wěn)定胞內(nèi)NO的含量，而且該過程影響胞內(nèi)GSH與NADH的含量，間接的調(diào)控細(xì)胞的氧化狀態(tài)［5］。本文主要就植物中GSNOR的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、表達(dá)部位以及參與植物生長發(fā)育、生物與非生物脅迫等過程進(jìn)行了概述，探討其在植物生長發(fā)育及脅迫反應(yīng)中的作用機(jī)制，旨為以后對(duì)GSNOR功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 植物中的GSNOR

在高等植物中首先在擬南芥中檢測(cè)到了GSNOR的活性，把擬南芥中一個(gè)推測(cè)的依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶的cDNA（AT5G43940）在酵母中表達(dá)，能夠恢復(fù)GSNO代謝缺陷的酵母對(duì)GSNO敏感的表型［6］，過表達(dá)或敲除GSNOR基因的植株都表現(xiàn)出短根的表型［7］。還有研究表明GSNOR通過蛋白的亞硝基化參與細(xì)胞死亡過程［8］。擬南芥GSNOR cDNA編碼一個(gè)由379個(gè)氨基酸（42.5 kD）組成的蛋白，該蛋白高度保守，與番茄中GSNOR的序列相似度達(dá)90%。半胱氨酸殘基（Cys）是氧化脅迫的重要修飾位點(diǎn)，參與氧化信號(hào)的傳導(dǎo)過程。植物的GSNOR含有14-16個(gè)Cys，其中的13個(gè)在植物中保守，Cys10、Cys271和Cys370位于蛋白的表面為進(jìn)行翻譯后修飾提供條件。

圖1 GSNOR調(diào)節(jié)植物細(xì)胞亞硝基化水平圖解

植物GSNOR缺失突變體中S-亞硝基硫醇（S-nitrosothiols，SNO）的含量升高，包括大分子量與小分子量的SNO，這暗示GSNOR的活性不僅調(diào)控植物中GSNO的含量，而且間接影響蛋白的亞硝基化水平，GSNOR缺失影響植物的正常生長發(fā)育，抗病性降低，對(duì)高溫敏感，對(duì)脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不敏感［9-10］（圖1）。目前，有許多GSNOR的相關(guān)突變體，擬南芥中有GSNOR缺失突變體（hot5-2/gsnor1-3）、過表達(dá)突變體和啟動(dòng)子區(qū)的插入缺失突變體（GSNOR的表達(dá)量卻上調(diào)），番茄中也有GSNOR的缺失或過表達(dá)突變體，這些為研究GSNOR的功能提供了條件。在過去20年中，GSNOR的功能被在多個(gè)物種中進(jìn)行了研究，如擬南芥、辣椒、番茄、向日葵、煙草、豌豆、花椰菜和萵苣等。

2 GSNOR的亞細(xì)胞定位

在擬南芥中利用GSNOR-GFP融合蛋白的方法分析了GSNOR的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)GSNOR在根、葉、種子和花（花藥、花絲、子房、柱頭、花瓣和花粉）中都有表達(dá)，特別是根尖和莖尖分生組織［11］。亞細(xì)胞定位研究證明GSNOR定位在細(xì)胞質(zhì)，但也有研究表明其定位在過氧化物酶體，還需要進(jìn)一步探討［12］。利用GSNOR的抗體發(fā)現(xiàn)在葉片橫切面上的微管組織及表皮細(xì)胞中也有表達(dá)［13］。在向日葵中發(fā)現(xiàn)GSNOR在下胚軸的皮層細(xì)胞與微管組織中表達(dá)［14］。在豌豆的葉片細(xì)胞中GSNOR亞細(xì)胞定位在葉綠體、胞質(zhì)、線粒體與過氧化物酶體，GSNOR的亞細(xì)胞定位與ROS和NO在細(xì)胞中的定位（過氧化物酶體、線粒體、葉綠體）重合，為細(xì)胞氧化狀態(tài)對(duì)GSNOR進(jìn)行調(diào)節(jié)提供了可能性［15］。

3 GSNOR參與植物對(duì)生物脅迫的反應(yīng)過程

GSNOR參與植物正常的生長發(fā)育過程，在擬南芥中除了成熟的花粉外其他組織中都有表達(dá)，但是在根和葉片中的表達(dá)量比較高［7］。在擬南芥中GSNOR參與胞內(nèi)SNO的形成，調(diào)控SNO的含量，參與植物的抗病反應(yīng)過程［16］。擬南芥中GSNOR缺失突變體的基因芯片結(jié)果表明，在170個(gè)下調(diào)的基因中1/3的基因是參與真菌感染脅迫反應(yīng)過程的［11］。在擬南芥中通過反義RNA干擾獲得的GSNOR低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)寄生霜霉（Peronospora parasitica）感染的抗性，可能與胞內(nèi)高含量的SNOs及抗病基因PR-1的高表達(dá)相關(guān)，GSNOR過表達(dá)植株中系統(tǒng)獲得性抗病能力下降，而且韌皮部有GSNOR的表達(dá)，有利于系統(tǒng)獲得性抗病信號(hào)通過韌皮部的傳導(dǎo)［17］。當(dāng)霍爾斯單軸霉（Plasmopara halstedii）感染向日葵下胚軸時(shí)，GSNOR的活性與GSNO的分布與含量負(fù)相關(guān)，GSNO原本在皮層中積累，當(dāng)感染霍爾斯單軸霉時(shí)GSNO則在表皮中積累，此處正是向日葵感染的部位，因此在感染前后從GSNO的分布位置改變來看GSNO可能與向日葵的抗性有關(guān)［18］。GSNOR參與了萵苣對(duì)生物營養(yǎng)霉菌的脅迫反應(yīng)過程，霉菌的感染能夠提高萵苣GSNOR基因及蛋白的表達(dá)量［19］。

4 GSNOR參與植物對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)過程

人們分析了不同脅迫條件下GSNOR的活性與表達(dá)情況，當(dāng)豌豆生長在50 μmol/L鎘的脅迫下，GSNOR的活性與轉(zhuǎn)錄水平下降了31%，并伴隨著NO、GSH及GSNO含量的減少［20］。在鎘的脅迫下三葉草中的GSNOR活性提高［21］。但是，在擬南芥中的研究結(jié)果卻相反，0.5 mmol/L的砷能抑制根的生長，并能造成氧化脅迫，當(dāng)擬南芥在0.5 mmol/L砷脅迫下，GSNOR的活性的活性顯著增加，并伴隨著NO的含量增加［22］。

在擬南芥中篩選得到一個(gè)對(duì)高溫敏感的突變體hot5-2，突變位點(diǎn)在GSNOR基因，暗示該酶可能與植物對(duì)溫度的抗性有關(guān)，然而，當(dāng)野生型的擬南芥遭受高溫脅迫條件時(shí)，GSNOR蛋白的表達(dá)量并沒有發(fā)生變化，也不影響Hsp101、sHspI 和sHspII等熱休克相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)量，這說明在擬南芥中GSNOR對(duì)耐熱性的影響不是通過熱休克蛋白通路來作用的。研究發(fā)現(xiàn)，突變hot5-2突變體中亞硝基化水平幾乎是野生型的2倍，細(xì)胞中的亞硝基化成分可導(dǎo)致亞硝基化脅迫，增加細(xì)胞中NO的含量。利用4-氨基-5-甲氨基-2'，7'-（4-amino-5-methylamino-2'，7'-di fl uorescein diacetate）（DAF-FM DA）對(duì)擬南芥的原生質(zhì)體進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，熱處理能夠引起野生型擬南芥中NO含量的輕微增加，而突變體中NO的含量本來就高，熱處理前后變化不明顯，外源NO的供體SNP能夠引起葉片黃化及死亡，突變hot5-2更嚴(yán)重，NO 清除劑cPTIO能提高擬南芥對(duì)熱的耐受性，內(nèi)源NO含量升高的突變體nox1也表現(xiàn)出熱敏感植物表型，因此，GSNOR可能夠通過調(diào)控內(nèi)源NO水平，從而影響植物熱敏感性［23］。向日葵幼苗在38℃下處理4 h，下胚軸中GSNOR的活性、蛋白及基因表達(dá)量都下調(diào)，同時(shí)SNOs的含量升高，推測(cè)GSNOR調(diào)節(jié)胞內(nèi)SNOs的含量，SNOs能夠釋放NO，參與蛋白的硝基化過程［24］，然而，將豌豆幼苗進(jìn)行相同處理，GSNOR的活性與SNOs的含量都是增加的［25］。將辣椒植株放在8℃下處理24 h，GSNO還原酶的活性增高32%，NO的含量降低50%，伴隨著GSH含量的升高［26］。煙草葉片在機(jī)械損傷2 h后GSNOR基因與蛋白的表達(dá)水平下調(diào)［27］。

高鹽脅迫影響植物的生長、限制作物的產(chǎn)量，在擬南芥中鈣調(diào)素4（CaM4）參與植物的非生物脅迫反應(yīng)過程，其缺失突變體表現(xiàn)出對(duì)高鹽脅迫敏感的表型。另外，NO也參與植物的高鹽脅迫反應(yīng)過程，GSNOR作為植物體內(nèi)NO穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控基因，研究表明CaM4通過與GSNOR結(jié)合，減低其活性，從而促進(jìn)NO的積累，調(diào)控植物的反應(yīng)過程［28］。向日葵幼苗根系對(duì)鹽脅迫的敏感性較高，在鹽脅迫下GSNOR活性顯著降低。將向日葵幼苗放在120 mmol/L NaCl處理下，二硫代赤蘚醇能夠恢復(fù)GSNOR活性，表明該酶的活性改變是可逆的。鹽脅迫增強(qiáng)了子葉中蛋白質(zhì)的亞硝基化，而根則表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的脫氮化。61種發(fā)生亞硝基化的蛋白中，17種是子葉特有的，4種是根特有的，而40種是兩者共同的。這些觀察結(jié)果表明，向日葵幼苗在鹽脅迫下，在NO的信號(hào)傳遞過程中通過S-亞硝基化和去硝基化作用調(diào)節(jié)各種酶活性［29］。

在碳酸氫鈉處理0.5-2 d，番茄中GSNOR的表達(dá)受到明顯的抑制，3 d后表達(dá)量開始上調(diào)，6 d達(dá)到最大，之后開始下調(diào)。過表達(dá)GSNOR基因的植株表現(xiàn)出對(duì)堿性鈉鹽脅迫的抗性，這與抗氧化基因APX、CAT、DHAR、GR的高表達(dá)有關(guān)；反義抑制GSNOR活性的植株則有敏感的表型，盡管SOS1、SOS2、SOS3、SOS4、H-ATPase、HKT1和HKT2基因表達(dá)量上調(diào)。但是，RNS和ROS的積累造成了非常嚴(yán)重的氧化脅迫，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［10］。

百草枯（1，1-二甲基-4，4'-聯(lián)吡啶鎓鹽二氯化物）是一種非選擇性除草劑，能誘導(dǎo)植物中超氧化物與過氧化氫的產(chǎn)生。Chen等在擬南芥中通過篩選得到了一株對(duì)百草枯不敏感的突變株par2-1，圖位克隆發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)在GSNOR基因中224位氨基酸殘基由甘氨酸變成了天冬氨酸，即HOT5基因，缺失突變體gsnor1/hot5/par2中NO的含量升高，過表達(dá)GSNOR/HOT5/PAR2基因能夠植株中NO的含量，NO供體SNP處理能提高植物對(duì)百草枯的抗性，即突變體par2-1中高含量的NO能緩解百草枯引起的細(xì)胞死亡，從而提高擬南芥對(duì)百草枯的抗性，這些結(jié)果表明GSNOR調(diào)控胞內(nèi)NO的穩(wěn)態(tài)［7］。在擬南芥中GSNOR還參與對(duì)損傷和水楊酸的脅迫反應(yīng)過程［27］。但是，向日葵下胚軸受到機(jī)械損傷時(shí)GSNOR的活性下調(diào)，伴隨著SNO含量的增加［14］。煙草葉片在受到機(jī)械損傷2 h后，GSNOR的mRNA和蛋白的表達(dá)水平都下調(diào)［27］。

植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）參與植物的抗逆反應(yīng)過程，在保衛(wèi)細(xì)胞中ABA能夠誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，研究表明NO通過亞硝酸化open stomata 1（OST1）/SnRK2.6（Sucrose nonfermenting 1-related protein kinase2.6）蛋白第137位的半胱氨酸，抑制氣孔開放，負(fù)調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞中ABA的信號(hào)傳遞過程，GSNOR基因缺失突變體gsnor1-3植株保衛(wèi)細(xì)胞中NO含量增加，由于SnRK2.6蛋白的亞硝基化，導(dǎo)致ABA不能誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉［30］。

5 GSNOR對(duì)細(xì)胞氧化水平的調(diào)節(jié)

生物與非生物脅迫都能造成植物體內(nèi)ROS或者活性氮NO/SNO的積累，破壞細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡，通過氧化作用調(diào)控含硫蛋白的活性，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的傳導(dǎo)。一方面，GSNO能夠儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)NO，對(duì)蛋白質(zhì)（酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子、離子通道等）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾，形成蛋白-Cys-SNO，即調(diào)控細(xì)胞內(nèi)SNO的水平，對(duì)NO的信號(hào)傳遞過程進(jìn)行微調(diào)；另一方面，GSNOR能夠調(diào)控胞內(nèi)GSNO/SNO的含量調(diào)控細(xì)胞的氧化狀態(tài)。另外，H2O2和除草劑也能夠抑制GSNOR的活性［31］，即氧化脅迫能對(duì)GSNOR進(jìn)行翻譯后修飾，ROS對(duì)GSNOR活性的抑制可能是抵抗氧化脅迫的保護(hù)機(jī)制，這些表明GSNOR可能ROS與RNS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點(diǎn)。SNP（Sodium nitroprusside，NO）的供體和除草劑共同處理能夠也提高野生型擬南芥對(duì)除草劑的抗性，可能是NO/SNO通過抑制GSNOR的活性抵抗氧化脅迫的一種機(jī)制，在馬鈴薯與水稻的研究中也得到了相同的結(jié)果［32］。NO與ROS的相互作用還表現(xiàn)在gsnor突變體在除草劑的處理下體內(nèi)H2O2的含量下降，可能是NO直接清除ROS形成過氧亞硝基（ONOO-）的結(jié)果［32］。另外，ONOO-還可以通過抑制SOD降低H2O2的產(chǎn)生［33］。三葉草在鎘的脅迫下，GSNOR活性提高，伴隨著NO和GSNO含量的下降，改變植物體的氧化還原狀態(tài)［21］，誘導(dǎo)ROS、NO、過氧亞硝酸鹽（ONOO-）和NADPH氧化酶、過氧化物酶和GSNOR的活性顯著增加［34］。另外，在免疫反應(yīng)過程中NO/SNO通過亞硝化抑制NADPH氧化酶的活性，降低ROS的產(chǎn)生［35］。最近的研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中抗壞血酸過氧化物酶1（APX1）的亞硝基化能增強(qiáng)其清除H2O2的能力，抵抗氧化脅迫［36］。豌豆在鹽脅迫條件下亞硝基化也能增強(qiáng)APX1的活性［37］。

6 展望

S-亞硝基谷胱甘肽（GSNO）是一個(gè)天然的NO儲(chǔ)存庫，因此研究GSNOR在植物生長發(fā)育及脅迫反應(yīng)中的作用機(jī)制，將有助于我們對(duì)NO生理功能的了解。最近的研究還證明GSNOR參與木質(zhì)部微管細(xì)胞的分化過程［38-39］，這表明我們對(duì)植物中GSNOR功能還知之甚少。在植物中GSNOR 基因的功能研究多局限于模式植物擬南芥中，且在多種脅迫條件下GSNOR的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平是可能其酶活性調(diào)控的主要形式，進(jìn)一步深入研究GSNOR影響的下游靶蛋白及靶蛋白亞硝基化修飾后功能的變化將是未來的一個(gè)研究方向。盡管大量的研究證明非生物脅迫調(diào)控GSNOR的表達(dá)，但還沒有直接的證據(jù)證明活性氧（ROS）直接影響GSNOR的表達(dá)，更有可能是一個(gè)翻譯后的修飾過程。GSNOR可能是ROS與RNS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點(diǎn)，盡管GSNOR參與調(diào)控細(xì)胞的氧化狀態(tài)，但是細(xì)胞內(nèi)各個(gè)部分的氧化狀態(tài)不是完全一致的，因此，細(xì)胞器的氧化狀態(tài)與GSNOR的關(guān)系將是未來的研究重點(diǎn)。