姚恒 楊大海 白戈 謝賀

（云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明 650021）

在植物中，多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）能將酚類物質(zhì)催化反應(yīng)出能直接殺滅病原菌的醌類物質(zhì)，被認(rèn)為對(duì)植物抗蟲、病菌等生物因素性脅迫是有益的。然而，因?yàn)镻PO催化產(chǎn)生深褐色的醌類物質(zhì)又直接危害果蔬、水稻及小麥等農(nóng)產(chǎn)品的外觀品質(zhì)，因此，過強(qiáng)的PPO酶活性對(duì)作物的品質(zhì)有害。植物中的PPO的功能具有多樣性，在豆類［1］、番茄［2-3］、馬鈴薯［4］、紅三葉草［5-6］、蘋果［7］、水稻［8］和小麥［9-10］等植物中已有大量的報(bào)道。育種學(xué)家在研究PPO基因功能的基礎(chǔ)上，根據(jù)需求選育出PPO酶活性強(qiáng)或者弱的品種，創(chuàng)制出抗病蟲害或者不易褐化的產(chǎn)品。煙草也存在抗病蟲害與低褐變煙葉品種的需求，利用現(xiàn)代分子標(biāo)記手段揭示煙草品種耐烤性的分子基礎(chǔ)，提出決定煙草品種耐烤性的候選基因［11-12］。但煙草PPO基因的功能研究主要集中在煙草調(diào)制過程中褐變與PPO酶活力相關(guān)性的研究［13-16］。針對(duì)煙草PPO基因功能的研究相對(duì)較少［17-23］。研究煙草PPO基因功能，需要?jiǎng)?chuàng)制突變體材料。CRISPR/Cas9技術(shù)于2015年成功應(yīng)用于煙草［24］基因功能研究，目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于煙草中CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用正在普及。為了獲得NtPPO1的定點(diǎn)突變體，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建煙草多酚氧化酶NtPPO1的編輯載體，篩選NtPPO1被定點(diǎn)編輯敲除的純合突變體。通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)到突變體中NtPPO1的相對(duì)表達(dá)量，突變體的創(chuàng)制為研究其基因功能奠定了材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

栽 培 煙 草 品 種（Nicotiana tabacum）K326、DH5α大腸桿菌與LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)為云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)室保存。pORE-CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體由西南大學(xué)惠贈(zèng)。引物合成和測(cè)序均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司（Invitrogen）完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和基因克隆 以煙草葉片cDNA為模板，根據(jù)NtPPO1序列設(shè)計(jì)引物（F：5'-ATGGC TTCTTCATTTGTTCTTCAAGC-3'；R ：5'-TTAACAA GGGACCAACTGGATCTCAAC-3'），利用 Q5 超保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)?；厥?、純化、連接和轉(zhuǎn)化，經(jīng)抗性篩選，PCR鑒定后挑選陽(yáng)性單克隆菌落測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)測(cè)序正確的NtPPO1序列，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)sgRNA序列：5'-CATTTGTTCTTCAAGCTCCA-TGG-3'作 為CRISPR/Cas9敲除NtPPO1的靶位點(diǎn)序列。

根據(jù)pORE-CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體構(gòu)建方法，需要在sgRNA靶序列添加核苷酸G與BsaⅠ的酶切接頭（F：5'-GATTGCATTTGTTCTTCAAGCTCCA-3'；R ：5'-AAACTGGAGCTTGAAGAACAAAT GC-3'）。sgRNA退火反應(yīng)：在PCR儀器中設(shè)定程序每8 s降低0.1℃，將混合單鏈引物從95℃降至4℃以形成引物DNA雙鏈。

利用BsaⅠ酶切pORE-CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體，將其與已退火好的靶位點(diǎn)DNA引物進(jìn)行連接，構(gòu)建成NtPPO1的CRISPR/Cas9載體。將目的載體直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用含卡那霉素的抗性培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。利用上游引物：5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'， 與 sgRNA 反向引物配合PCR篩選陽(yáng)性菌落。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建與煙草遺傳轉(zhuǎn)化 提取克隆載體中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。利用含載體農(nóng)桿菌浸染煙草葉盤8-10 min。然后經(jīng)過2 d共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至含有NAA、6-BA和卡那霉素（50mg/L）以及頭孢噻肟鈉（500 mg/L）的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行組培再生，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。

1.2.4 煙草NtPPO1突變體的篩選 提取轉(zhuǎn)基因煙草植株DNA。利用Kana引物（F：5'-CAGGTTCTCC G G C C G C T T G G-3'，R ：5'-GGAGATCCTGCCCCGG-CACT-3'） 進(jìn) 行PCR，檢測(cè)陽(yáng)性植株。利用Cas9引物（F：5'-TGTCGGGACAGGGCGACAGT-3'，R：5'-CGCCGCGTTCAGCCTTTGTG-3'）進(jìn)行 PCR，檢測(cè)陽(yáng)性植株。

挑取經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的煙草小苗，設(shè)計(jì)包含靶位點(diǎn)區(qū)域的長(zhǎng)度為770 bp的片段引物（F：5'-TTCACGCACTAATTCGTCTCATTGGA-3'，R：5'-TCTGTCGGCAACGCCTTCA-3'）進(jìn)行檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增NtPPO1片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序、比對(duì)后，分析轉(zhuǎn)基因后代植株中NtPPO1在靶位點(diǎn)處核苷酸序列變化。

基因編輯成功的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性T1植株，分單株套袋自交收獲T2種子。播種萌發(fā)T2種子獲得T2小苗100株，提取T2植株DNA，利用上述方法檢測(cè)NtPPO1突變情況，并分析T2純合突變煙草中NtPPO1序列在靶位點(diǎn)處突變類型。

1.2.5 煙草NtPPO1的Real time-PCR檢測(cè) 按照Quant qRT-PCR kit（SYBR Green）（TIANGEN 公司）使用說明在QuantStudioTM6 Flex熒光定量PCR儀器（ABI公司）上進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)，利用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以sigmplot軟件繪制qRT-PCR分析圖。分析NtPPO1的相對(duì)表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)?6S。所需引物為NtPPO1_qRT_F：5'-AGCACTGCCTTTATTGATGATGG-3'，NtPPO1_qRT_R：5'-ACTTAGCTATGTATTCGTCATCTACAGTT-3'。26S_F：5'-GAAGAAGGTC C C A A G G G T T C-3'，2 6 S_R ：5'-TCTCCCTTTAACAC-CAACGG-3'。

2 結(jié)果

2.1 NtPPO1全長(zhǎng)cDNA序列驗(yàn)證

如圖1所示，利用設(shè)計(jì)的克隆引物以煙草cDNA為模板，特異性擴(kuò)增出一條約1.8 kb的片段，經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析NtPPO1的基因座（圖2-A），NtPPO1編碼序列為1 746 bp，其外顯子有3個(gè)，其中第2外顯子可以選擇性拼接。測(cè)序發(fā)現(xiàn)5個(gè)克隆中有4個(gè)克隆的NtPPO1編碼序列為1、2、3外顯子拼接而成（圖2-B），另外1個(gè)克隆的NtPPO1編碼序列為1、3外顯子拼接而成（圖2-C）。NtPPO1可變剪切形式為外顯子跳過，在不改變起始位點(diǎn)的情況下，NtPPO1轉(zhuǎn)錄后的mRNA會(huì)提前出現(xiàn)終止密碼子。跳過的第2外顯子序列為5'-GTACTTATA CTTCCATGAGAGAATCTTGGCTTCCCTAATTGG TGACCCTACATTTGCTTTGCCATATTGGAATTGG GACCATCCTAAAGGCATGCATTTGCCTGACATG TTTGATGTCGAAG-3'。

在野生型的煙草植株中，NtPPO1就存在2種不同的轉(zhuǎn)錄形式，雖然轉(zhuǎn)錄本會(huì)提前出現(xiàn)終止子（圖2-C），但是煙草中保存這種轉(zhuǎn)錄剪切方式應(yīng)該有其重要的生理功能，推測(cè)這種無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解（Nonsense-mediated mRNAdecay，NMD）可以監(jiān)控細(xì)胞中的mRNA水平以便煙草能夠快速的響應(yīng)外界刺激。

圖1 NtPPO1的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 NtPPO1基因座圖

2.2 NtPPO1突變靶位點(diǎn)的選擇與載體構(gòu)建

NtPPO1的CDS序列經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證后，選取翻譯起始密碼子ATG后第11-30的20 bp核苷酸序列作為敲除基因的靶位點(diǎn)序列，構(gòu)建CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體，目標(biāo)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，圖3顯示，通過測(cè)序驗(yàn)證篩選出含sgRNA序列正確插入到CRISPR/Cas9表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株。

含正確插入sgRNA的基因編輯載體，利用農(nóng)桿菌葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)過組培再生成轉(zhuǎn)基因T1代植株。

圖3 pORE-CRISPR/Cas9∷sgRNA基因編輯載體

2.3 NtPPO1敲除陽(yáng)性T1植株篩選

通過測(cè)序方法篩選NtPPO1被編輯的轉(zhuǎn)基因植株T1（圖4），編輯成功的T1植株在sgRNA-PAM位點(diǎn)后序列經(jīng)測(cè)序出現(xiàn)雙峰，并且測(cè)序峰圖紊亂的情況明顯不一致，說明Cas9蛋白在切斷目標(biāo)序列后，DNA修復(fù)的情況有差異。將此三類轉(zhuǎn)基因T1雜合突變植株盆栽后自交收種。經(jīng)過自交分離后產(chǎn)生的T2代植株中，會(huì)得到三類NtPPO1純合突變的T2植株。

圖4 NtPPO1定點(diǎn)敲除轉(zhuǎn)基因T1植株篩選

2.4 NtPPO1突變體的檢測(cè)

經(jīng)測(cè)序分析T2植株NtPPO1在目標(biāo)敲除序列后（圖5），突變體M1植株的NtPPO1缺失了1個(gè)G堿基，M2植株的NtPPO1缺失了2個(gè)G堿基，M3植株的NtPPO1突變是插入了1個(gè)A堿基，此3類突變都會(huì)造成NtPPO1編碼序列的移碼突變，如果轉(zhuǎn)錄出mRNA，在起始閱讀框不變的情況下會(huì)提前出現(xiàn)終止密碼子。

圖5 T2代轉(zhuǎn)基因植株NtPPO1的突變類型

圖6 T2轉(zhuǎn)基因植株中NtPPO1的相對(duì)表達(dá)量分析

2.5 突變體內(nèi)NtPPO1相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

測(cè)定NtPPO1純合突變植株M1、M2、M3的基因表達(dá)量如圖6所示，相對(duì)于野生型對(duì)照，M1、M2、M3突變體NtPPO1的表達(dá)量分別下降了75%、84%和76%。結(jié)果表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制的NtPPO1的突變體也影響了此基因的轉(zhuǎn)錄。在DNA水平上的點(diǎn)突變，造成了基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。NtPPO1的突變是位于第1外顯子區(qū)域，而不是位于啟動(dòng)子區(qū)域。理論上，造成NtPPO1表達(dá)量降低就應(yīng)該發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的水平調(diào)控，具體是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的哪個(gè)時(shí)期還有待進(jìn)一步的研究。

圖7 NtPPO1純合突變體植株表型

2.6 轉(zhuǎn)基因煙株表型

如圖7所示，利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制的NtPPO1突變體與對(duì)照野生型煙草之間的田間外觀表型無(wú)明顯差異。

3 討論

本研究選取了一個(gè)煙草多酚氧化酶NtPPO1進(jìn)行基因序列克隆驗(yàn)證，結(jié)果表明，NtPPO1存在一種可變剪切形式。在驗(yàn)證了NtPPO1序列的基礎(chǔ)上，采用CRISPR/Cas9技術(shù)，創(chuàng)制1、2 bp堿基缺失和1 bp堿基插入的NtPPO1定點(diǎn)純合突變體M1、M2和M3。通過基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，突變體中NtPPO1表達(dá)水平有顯著的下降。

植物中的PPO功能具有多樣性。根據(jù)前人的研究結(jié)果，PPO與植物抗蟲、抗細(xì)菌性病害的能力相關(guān)。但是，在一些作物中通過降低作物中的PPO酶活，會(huì)減輕農(nóng)作物發(fā)生褐變的程度，如在葡萄［25］、小麥［26］、水稻［27］等作物中的結(jié)果顯示，低的PPO活力能不同程度的顯示出不易褐變、耐貯藏的特性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)基因測(cè)序的結(jié)果顯示，NtPPO1已經(jīng)被成功敲除，并且基因的表達(dá)量也發(fā)生了顯著的下降。王曼玲等［28］報(bào)道植物的PPO一般存在多個(gè)基因編碼，而本研究普通栽培煙草中的PPO基因至少有15個(gè)（研究未發(fā)表），單獨(dú)敲除某一個(gè)PPO基因，可能會(huì)由于另外一個(gè)PPO基因在功能上互補(bǔ)，造成植株整體上的PPO活力下降并不顯著。所以需要研究煙草中的PPO基因的功能，還需要進(jìn)一步的創(chuàng)制出各PPO基因的突變體，甚至是煙草PPO雙、三基因突變體，才能更全面的研究PPO基因功能。

根據(jù)qPCR測(cè)定結(jié)果顯示CRISPR/Cas9創(chuàng)制的NtPPO1的純合突變體其NtPPO1的表達(dá)水平顯著降低。說明利用CRISPR/Cas9在煙草中創(chuàng)制某個(gè)基因的定點(diǎn)突變時(shí)，也可能會(huì)影響此基因轉(zhuǎn)錄。這個(gè)結(jié)果和Cai等［29］在大豆中的研究結(jié)果類似，Cai等在大豆中靶向敲除控制開花的基因GmFT2a，在長(zhǎng)日照和短日照的條件下，GmFT2a的相對(duì)表達(dá)量下降。根據(jù)Wu等［30］的研究表明，真核生物中，如果基因序列存在早期終止子（Premature termination codons，PTCs），相對(duì)于沒有PTCs的mRNA，攜帶PTCs的mRNA會(huì)通過無(wú)義mRNA降解途徑（Nonsensemediated mRNA decay pathway）快速降解，防止因翻譯出無(wú)意蛋白的積累才啟動(dòng)降解蛋白調(diào)控。本研究利用CRISPR/Cas9在NtPPO1靠近起始密碼子的核苷酸序列上引入了移碼突變，結(jié)果提前出現(xiàn)了終止密碼子，可能啟動(dòng)了煙草本身的NMD調(diào)控途徑，進(jìn)而造成了NtPPO1的轉(zhuǎn)錄下降。當(dāng)然，這只是一個(gè)推論。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制NtPPO1突變體，其NtPPO1表達(dá)水平發(fā)生下降的機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。

本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)獲得了煙草PPO基因NtPPO1的編輯敲除突變體，對(duì)NtPPO1的功能進(jìn)行了初步研究，為煙草PPO基因功能研究和煙草育種奠定了材料基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆驗(yàn)證了煙草多酚氧化酶NtPPO1編碼序列，并利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功創(chuàng)制了3個(gè)NtPPO1定點(diǎn)突變體材料，NtPPO1在突變體中的表達(dá)量顯著降低，而突變材料與對(duì)照煙草表型上無(wú)顯著差異。