李天真 周威 殷華 張同存 劉濤

（1. 天津科技大學，天津 300457；2. 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308）

苦碟子又名苦荬菜，學名抱莖苦荬菜（Ixeris sonchifoliaHance），為菊科苦荬菜屬草本植物，主要分布于我國北部、東部地區(qū)。苦碟子干燥全草可入藥，味苦、辛、性寒，具有清熱解毒、活血化瘀及排膿止痛之功效［1］?？嗟幼⑸湟菏且钥嗟訛樵咸崛【贫傻撵o脈注射液，具有多種藥理功效，如抗血小板聚集，抑制血栓形成，降低血管阻力等作用?？嗟幼⑸湟旱幕瘜W成分復雜，含有酚酸類、黃酮類、核苷類和倍半萜內(nèi)酯類等多種化合物［2-4］，其中酚酸類化合物有綠原酸和二咖啡酰奎尼酸等［5-7］。由于酚酸類化合物具有酚羥基或苯烯結構，具有廣泛的生理活性（如抗氧化［8］、抗紫外線［9］、抗腫瘤作用［10］、抑菌［11］等），在食品、醫(yī)藥、化妝品原料方面有著廣泛的用途［12-13］。因此，植物體內(nèi)的酚酸類化合物生物合成受到廣泛的研究。

綠原酸（Chlorogenic acid），化學名3-O-咖啡?？崴幔?-O-caffeoylquinic acid），是一種新型的抗氧化劑，在食品和醫(yī)藥領域都有廣泛用途。目前已報道植物中綠原酸生物合成途徑存在3種：（1）香豆酰輔酶A作為?；w，在對香豆酰轉移酶（HQT或者HCT）的催化作用下與奎尼酸縮合生成香豆?？崴?，進而在香豆酸-3-羥化酶作用下生成綠原酸；（2）?；w為咖啡酰葡萄糖苷，其經(jīng)絲氨酸羧肽酶（SCPL）的作用下與奎尼酸縮合生成綠原酸；（3）對香豆酰轉移酶（HCT）催化莽草酸與香豆酰輔酶A合成香豆酰莽草酸，進而在香豆酸-3-羥化酶作用下生成咖啡酰莽草酸。對香豆酰轉移酶（HCT）催化咖啡酰輔酶A與奎尼酸合成綠原酸。在途徑1和3中，對香豆酰轉移酶（HCT）是綠原酸生物合成的關鍵酶，屬于BAHD酰基轉移酶家族，該酶類的氨基酸序列具有兩個高度保守的催化活性區(qū)域“HXXXDG”和“DFGWG”。目前在多種植物中都有HCT酰基轉移酶的報道，如Lellemand等［14］從中果咖啡（Coffea canephora）中擴增得到HCT基因；Legrand等［15］從菊苣（Cichorium intybus）中獲得兩條HCT?；D移酶，并證明具有在植物體中催化綠原酸合成的活性。此外，在金銀花［16］、朝鮮薊［17］等多種植物中也有HCT?；D移酶的報道。

目前，苦碟子中HCT?；D移酶類尚未見報道。為研究苦碟子中酚酸類化合物的生物合成及關鍵基因功能鑒定，本研究對苦碟子葉片轉錄組進行了高通量測序，并結合生物信息學分析以及RT-PCR技術，得到一條HCT全長基因。通過氨基酸序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，對其氨基酸特點進行分析。在大腸桿菌中對該基因與對香豆酰輔酶A連接酶（At4CL）進行共表達，并通過飼喂前體物咖啡酸和奎尼酸實現(xiàn)了綠原酸的合成，證明該酶為HCT酰基轉移酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 本實驗室保存的菌株大腸桿菌transT1用于質粒的擴增及基因克隆，大腸桿菌BL21（DE3）用于蛋白的過表達及綠原酸的合成。質粒pET28a與質粒pCDFDuet購于Novagen公司。

1.1.2 植物材料 本實驗所用苦碟子為溫室培育3個月的幼苗，選取3個月以上的葉片作為實驗材料，置于液氮速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆??？嗟愚D錄組數(shù)據(jù)及總 RNA 的抽提是由華大公司完成。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)基 KOD-plus-New高保真DNA聚合酶購自東洋坊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ購自Fermentas公司；反轉錄試劑盒購自TransGen Biotech公司；T4連接酶購自TaKaRa Biotechnology公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自北京索萊寶生物科技有限公司；咖啡酸、奎尼酸購自天津希恩思化學試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，用于質粒的構建、擴增、種子液的準備；M9Y培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g/L，磷酸氫二鈉12.8 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，NaCl 0.5 g/L，氯化銨1 g/L，葡萄糖2 g/L，硫酸鎂2 mmol/L，氯化鈣0.1 mmol/L。適量的抗生素：鏈霉素 200 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 cDNA的合成及基因PCR擴增 以1 μg苦碟子總RNA為模板，以Oligo（dT）18為引物，按TransScript反轉錄酶說明書所述反應條件，合成單鏈cDNA。取1 μL反轉錄產(chǎn)物，在50 μL體系中進行目的基因的PCR擴增。IsHCT的引物為IsHCT-5FNcoⅠ：CATGCCATGGGAAGTGATCAGAAGATG ATGATG（下劃線為NcoⅠ酶切位點）；IsHCT-3RHind Ⅲ：CCCAAGCTTTTACAATTCATACAAAAA CTTCTC（下劃線為Hind Ⅲ酶切位點）。PCR條件為：94℃預變性2 min，98℃變性10 s，58℃復性30 s，68℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，凝膠電泳回收目的片段。

At4CL（GenBank：KX817185.1）來自植物擬南芥（Arabidopsis thaliana），以擬南芥全長cDNA為模板，PCR引物為At4CL-5F-NcoⅠ：AAAACCATGGCGCCACAAGAACAAGCAG（ 下 劃 線為NcoⅠ 酶 切 位 點 ）At4CL-3R-BamH I：AAAAGGATCCTCACAATCC-ATTTGCTAG（下劃線為BamHⅠ酶切位點），PCR條件同上，凝膠電泳回收目的片段。

1.2.2 載體構建 pET28a質粒和IsHCT分別用NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，載體和基因片段通過瓊脂糖凝膠電泳回收，用T4 DNA連接酶對載體和片段進行連接，轉化大腸桿菌transT1，獲得重組載體pET28a-IsHCT。pCDFDuet質粒和At4CL分別用NcoⅠ和BamH I雙酶切，載體和基因片段通過瓊脂糖凝膠電泳回收，用T4 DNA連接酶對載體和片段進行連接，轉化大腸桿菌transT1，獲得重組載體pCDFDuet-At4CL。

1.2.3 重組菌構建 將載體pET28a-IsHCT和pET28a分別轉化至大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（DE3）/IsHCT和 BL21（DE3）/W 用 于 蛋白表達。將載體pET28a-IsHCT與載體pCDFDuet-At4CL共同轉化至大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（DE3）/IsHCT-At4CL。再將載體pET28a和pCDFDuet共同轉化至大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（DE3）/WW，作為對照菌株，用于發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.4 SDS-PAGE檢測蛋白表達 分別挑取重組菌BL21（DE3）/W和BL21（DE3）/IsHCT的單克隆于5 mL液體LB中，37℃過夜培養(yǎng)；按體積比為1∶50轉接至50 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于30℃進行蛋白誘導6-8 h后，收集菌液2 mL，12 000 r/min離心10 min；加入1 mL的50 mmol/L Tris HCL緩沖液（pH 7.4）重懸菌體，取40 μL重懸液于1.5 mL離心管中，加入10 μL的5×loading buffer，沸水浴10 min，12 000 r/min 離心 10 min，上樣量 5 μL。

1.2.5 重組菌發(fā)酵培養(yǎng) 挑取重組菌BL21（DE3）/IsHCT-At4CL和BL21（DE3）/MM菌株單克隆于5 mL液體LB中，37℃過夜培養(yǎng)；按體積比為1∶50轉接至50 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于16℃進行蛋白誘導12 h，收集菌體于50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，更換M9Y培養(yǎng)基，同時在培養(yǎng)基中添加2 mmol/L的咖啡酸和2 mmol/L的奎尼酸，30℃培養(yǎng)24 h，取上清進行HPLC檢測。

1.2.6 綠原酸的HPLC和LC-MS分析鑒定 取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，收集上清。HPLC檢測系統(tǒng)是島津液相色譜儀；檢測條件為：HPLC流動相A = 水（含0.1%甲酸），B = 甲醇；流速 = 1 mL/min，溶液配比為等濃度梯度，洗脫條件：0-25 min 80% A和20% B；25-30 min 100% B；31-40 min 80% A 和20% B。進樣量20 μL；液相色譜柱為 Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV檢測波長為310 nm。

LC-MS檢測：配有紫外檢測器的安捷倫1260系統(tǒng)和配有ESI離子源探針的bruker microQ-TOFⅡ質譜儀。檢測條件包括：Agela Innoval MP C18柱（4.6×250 mm）；UV檢測波長為310 nm；流動相A= 水（含0.1%甲酸），B = 甲醇；流速 = 1 mL/min，溶液配比為等濃度梯度，洗脫條件：0-25 min 80%A 和 20% B；25-30 min 100% B；31-40 min 80% A和20% B。進樣量20 μL；ESI正離子源，分子量掃描范圍50-800。

圖1 IsHCT基因擴增片段凝膠電泳

2 結果

2.1 IsHCT基因的克隆

通過苦碟子的轉錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)一條HCT基因序列，該基因具有完整編碼區(qū)的轉錄本，長度為1 320 bp，根據(jù)該ORF的序列設計基因的擴增引物，用RT-PCR方法擴增獲得了完整基因（圖1），命名為IsHCT基因（GenBank：MH151086）。

圖2 IsHCT氨基酸序列分析

2.2 IsHCT蛋白序列分析

IsHCT與已報道的對香豆酰轉移酶，包括來源菊苣（Cichorium intybus）中的 CiHCT（ANN12610.1）、金銀花（Lonicera japonica）中的 LjHCT（AFS68800.1）、桔 梗（Platycodon grandiflorus） 中 的 PgHCT（AEM63676.1）、刺苞菜薊（Cynara cardunculus var.Scolymus） 中 的 CsHQT（ACJ23164.1） 和 煙 草 中（Nicotiana tabacum L.）的 NtHCT（XP_016484287.1），進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)該酶含有BAHD?；D移酶保守序列 HXXXDG 和 DFGWG（圖2）。

2.3 IsHCT蛋白序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對IsHCT氨基酸序列進行同源比對，結果（圖3）顯示，IsHCT的氨基酸序列與菊苣中的 CiHCT（ANN12611.1）的序列同源性高達95%。通過 MEGA5.10軟件構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)IsHCT與菊苣的CiHCT遺傳距離最近，二者聚為一小支。

圖3 IsHCT基因系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 載體pET28-IsHCT的構建和驗證

將擴增的IsHCT分別用NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，同時對載體pET28用相同的酶酶切，將IsHCT片段插入到載體pET28a中得到重組載體pET28a-IsHCT（圖4-B）。對重組載體用NcoⅠ，Hind Ⅲ酶切驗證，pET28a-IsHCT得到大小為1.3 kb和5.3 kb的兩條帶（圖4-A），與理論條帶大小一致，并送金唯智公司進行測序驗證。

2.5 蛋白IsHCT SDS-PAGE分析

菌株BL21（DE3）/W和BL21（DE3）/IsHCT按照1.2.4的方法進行培養(yǎng)并誘導蛋白表達，通過對其全細胞蛋白SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，蛋白大小為48.27 kD（圖 5）。

2.6 大腸桿菌發(fā)酵菌株的構建

將載體pET28a-IsHCT與pCDF-At4CL共轉入到大腸桿菌 BL21（DE3）中，得到重組菌株BL21（DE3）/IsHCT-At4CL。并將載體 pET28a和pCDFDuet 轉入BL21（DE3）作為上述菌株的對照菌株BL21（DE3）/WW。對重組菌進行兩步法發(fā)酵，并在第二步轉換M9Y培養(yǎng)基時向培養(yǎng)基中添加咖啡酸和奎尼酸。本研究中所構建的綠原酸在大腸桿菌中的合成途徑如圖6所示。

圖4 載體pET28a-IsHCT的構建

圖5 BL21（DE3）/W與BL21（DE3）/IsHCT的SDSPAGE檢測圖

2.7 綠原酸HPLC檢測及LC-MS鑒定

取24 h的發(fā)酵液進行HPLC檢測，在16 min處有新化合物的產(chǎn)生，與綠原酸標準品的峰保留時間（Rt）一致（圖7-A）。綠原酸的分子量為354，LC-MS檢測結果顯示16 min峰的［M+H］+= 355，確定該峰對應的化合物為綠原酸（圖7-B）。

圖6 綠原酸的合成途徑

3 討論

苦碟子中含有多種酚酸類化合物，如綠原酸、單咖啡酰酒石酸、菊苣酸等，但是這些化合物在苦碟子中的分子機制尚有待深入研究。本研究在對苦碟子轉錄組分析的基礎上，篩選出一條HCT基因。該基因序列長1 320 bp，編碼439個氨基酸。系統(tǒng)進化分析得出其與菊苣CiHCT同源性高達95%，其次與CsHQT同源性也很高，且IsHCT與CiHCT、CsHQT聚為一大分支。據(jù)文獻報道，CiHCT參與了菊苣植物體內(nèi)的綠原酸的合成［15］，推測出IsHCT很有可能是參與了苦碟子中綠原酸等酚酸類物質合成的重要功能基因。

HCT作為植物體苯丙素類化合物合成途徑的關鍵酶，在植物體次生代謝物（酚酸類化合物、木質素、黃酮類物質等）合成過程及代謝物量的平衡中起著重要作用［18］。有研究表明，降低植物中HCT基因的表達量，對香豆酰輔酶A則更多的被查爾酮合酶催化生成黃酮類物質［19］。此外，HCT不僅可以催化咖啡酰輔酶A與奎尼酸合成綠原酸，還可以逆向催化綠原酸生成咖啡酰輔酶A與奎尼酸，從而促使更多底物用于木質素的合成［20］。本研究獲得了苦碟子中的IsHCT序列，通過體內(nèi)酶實驗，驗證了IsHCT具有香豆酰轉移酶功能，能催化綠原酸的合成，為苦碟子中綠原酸的合成研究及其在苦碟子中次級代謝物間的調(diào)控機制研究奠定重要的基礎。后續(xù)研究可以通過調(diào)控IsHCT基因的表達等進而調(diào)控苦碟子中綠原酸的含量，對提高苦碟子藥材的品質具有重要意義。

4 結論

本研究從苦碟子中擴增出IsHCT基因，有酰基轉移酶的保守區(qū)域HXXXDG和DFGWG，與菊苣中CiHCT基因相似性高達95%。通過IsHCT基因在大腸桿菌中過表達及前體飼喂實現(xiàn)了綠原酸的合成，明確了IsHCT基因具有對香豆酰轉移酶功能。