金巧 劉霞 甘志凱

（南昌理工學(xué)院新能源與環(huán)境工程學(xué)院，南昌 310000）

木通紅喀木虱的寄主植物是木通、白木通等木通科植物，它廣泛分布于我國及、日韓等鄰國［1-5］。木通紅喀木虱不僅危害植物，其攜帶傳播的植物病毒等更是危害嚴(yán)重［6-10］。為保護(hù)木通等藥用植物資源，了解木通紅喀木虱生物學(xué)性質(zhì)，尋找其生理生化特性，對其線粒體基因組的研究尤為重要。然而，我國對木虱的研究起步較晚，且進(jìn)展緩慢，遠(yuǎn)落后于許多國家。

本研究基于PCR擴(kuò)增、基因克隆等技術(shù)通過拼接得到木通紅喀木虱線粒體全長，并獲得其結(jié)構(gòu)及堿基含量，蛋白質(zhì)基因及密碼子，核糖體RNA和轉(zhuǎn)運(yùn) RNA基因等情況。利用DNAStar 6.0、Mega 6.0軟件獲得序列的總長、堿基含量、密碼子使用、氨基酸組成等統(tǒng)計分析。通過木虱線粒體基因組序列的研究，能夠了解其在木虱科及同翅目系統(tǒng)發(fā)育中的地位，及其與同翅目其他昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［11-13］。線粒體基因的諸多優(yōu)勢，如保守性高、變異較快、有較快的進(jìn)化速率、母系遺傳及遺傳過程中不發(fā)生重組等［14-18］，使得在研究木虱系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化關(guān)系、親緣關(guān)系、系統(tǒng)地理學(xué)研究和物種鑒定等問題上有重大意義。此外，由于該線粒體基因組序列的測定為物種的鑒定提供重要分子支持，所以在害蟲預(yù)警，預(yù)防生物入侵上均有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的木通紅喀木虱樣品2017年7-8月采集于江西省九江，現(xiàn)保存在南昌大學(xué)螨類實驗室，-20℃冰箱保藏。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物純化 挑取3-4齡木通紅喀木虱幼蟲進(jìn)行總DNA提取。方法參照Qiagen DNeasy Tissue Kit說明書提取總DNA。

根據(jù)引物設(shè)計原則，參考mtDNA的通用引物［19-20］和白粉虱Trialeurodes vaporariorum的長片段引物以及其他相關(guān)種類的全線粒體基因組測序的PCR引物［21-22］，盡量在保守區(qū)域進(jìn)行引物的設(shè)計，同時考慮引入簡并位點增加引物通用性和引物步移的方法來設(shè)計引物，同時還要考慮各設(shè)計PCR引物要覆蓋線粒體基因組全序列。

首先采用昆蟲線粒體基因（cox1［19］、cox3［23］、cob［19］、rrnS［19］、rrnL［19］和 nad5［23］）的 5 對通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了木通紅喀木虱線粒體cox1、cox3、nad5、cob、12S rRNA和16S rRNA 6個基因的部分序列。然后再根據(jù)所上述基因測序結(jié)果，設(shè)計出相應(yīng)的特異性引物（表1）。然后根據(jù)上述擴(kuò)增長片段引物用LaTaq DNA聚合酶酶（TaKaLa）擴(kuò)增，得到4個長片段。

Long-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序見表1。對于小于1 kb的擴(kuò)增片段，采用2×Mix Taq DNA聚合酶；而對于擴(kuò)增1 kb以上的大片段，則利用LA Taq DNA聚合酶。PCR產(chǎn)物純化參照上海生工SanProp柱式DNA膠回收試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.2 克隆、測序與測序結(jié)果拼接 PCR擴(kuò)增出單一條帶的PCR產(chǎn)物直接測序或進(jìn)行克隆。對于擴(kuò)增出非特異條帶的PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收試劑盒（上海生工）回收后，首先在Nanovue超微量紫外分光光度計上測定濃度及純度。然后將PCR產(chǎn)物純化，純化后的目的基因連接至pGEM-T Easy載體上，將重組子轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α。最后通過藍(lán)白斑篩選法挑取1-2個陽性克隆菌，送至上海生工進(jìn)行雙向測序。

利用DANStar中的SeqMan軟件對已測的木通紅喀木虱mtDNA中的短片段和長片段進(jìn)行拼接和校正。在原始測序峰圖的基礎(chǔ)上對拼接結(jié)果進(jìn)行人工校正，去除空間隔區(qū)和校正錯誤堿基。

1.2.3 線粒體基因組基因注釋與基因組成情況的分析 利用NCBI網(wǎng)站上的ORF軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）注釋蛋白質(zhì)編碼基因，并通過木虱科的昆蟲全線粒體基因組序列比對方式及MITOS WebServer程序鑒定木通紅喀木虱線粒體基因組tRNA和rRNA。

線粒體基因組注釋完后利用DNAStar 6.0軟件包中的Editseq及Mega 6.0進(jìn)行序列的總長、堿基含量、密碼子使用、氨基酸組成等統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 木通紅喀木虱線粒體基因組分析

2.1.1 基因組的結(jié)構(gòu)分析 木通紅喀木虱全線粒體基因組長度為14 832 bp（圖1）（NCBI登錄號為NC_027087.1）。此線粒體基因組總共編碼37個基因，包括13個蛋白質(zhì)編碼基因、22個轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因，2個核糖體RNA基因，其中L鏈編碼14個基因，包括4個蛋白質(zhì)基因：nad1、nad4、nad4L、nad5；8個轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因：trnF、trnH、trnP、trnL1、trnV、trnQ、trnC、trnY；2個核糖體RNA基因：rrnL（16S核糖體RNA基因）和rrnS（12S核糖體RNA基因）。剩余的23個基因則由H鏈編碼，這些蛋白質(zhì)編碼基因、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因和核糖體RNA基因的位置以及結(jié)構(gòu)都很保守。

2.1.2 堿基組成特點 如表2所示，木通紅喀木虱全線粒體基因組的A+T含量為72.04%。蛋白質(zhì)編碼基因的A+T含量略有降低為70.50%，tRNA基因A+T含量為74.69%，rRNA基因的A+T含量最高為77.06%。同時，還可得到G、C堿基含量偏斜度遠(yuǎn)高于A、T堿基的結(jié)果，AT-skew值為0.059且GC-skew值為-0.284，其中T堿基含量高于A堿基含量，C堿基含量高于G堿基含量。

2.1.3 蛋白質(zhì)編碼基因及密碼子使用情況 由表3看出蛋白質(zhì)編碼基因密碼子3個位置的堿基組成情況。3個位置的A+T含量均遠(yuǎn)高于G+C含量，且密碼子第3位的A+T含量最高，AT-skew絕對值為0.155，而GC-skew絕對值僅為0.083。

圖1 木通紅喀木虱線粒體基因組結(jié)構(gòu)圖示

使用Mega 6.0軟件分析木通紅喀木虱13個蛋白質(zhì)編碼基因的相對同義密碼子使用頻率（Relative synonymous codon usage，RSCU）。對于有兩個同義密碼子的氨基酸，第3位點為A和U的密碼子使用頻率較高；對于有4個同義密碼子的氨基酸來說，H鏈編碼基因偏向于使用第3位點為A的密碼子，而L鏈偏向于使用第3位點為U的密碼子（表3）。

表2 木通紅喀木虱線粒體基因組堿基組成

分析密碼子使用情況可知，木通紅喀木虱線粒體中有6種密碼子的使用率很高，由高到低依次為UUU（F）、UUA（L）、AUU（I）、UCU（S2）、UAU（Y）和AAU（N）。分析氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，Leu氨基酸編碼量最高為15.63%；其次Ser、Ile和Phe分別為10.83%、10.08%和9.89%。而Cys最低僅為1.03%（表4）。

2.1.4 核糖體RNA（rRNA）基因 木通紅喀木虱線粒體基因組上的兩個核糖體RNA基因（rrnL和rrnS）長度分別為1 153 bp和806 bp，兩者分別位于trnL和trnV，trnV和CR之間，即trnV將兩個rRNA間隔開（圖2）。分析堿基組成可得rRNA基因A+T含量為77.06%，A+T含量偏向性明顯，且AT-skew值為0.075，GC-skew值為-0.339。

2.1.5 轉(zhuǎn)運(yùn) RNA（tRNA）基因 木通紅喀木虱線粒體基因組上的22個tRNA基因總長為1 393 bp，其中最長72 bp，而最短54 bp，僅有一個trnS1不能形成三葉草結(jié)構(gòu)。多數(shù)tRNA形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)，非典型三葉草結(jié)構(gòu)的tRNA情況各異（圖3）。

其 中 trnA、trnD、trnQ、trnS2、trnT、trnV的TΨC臂上存在嚴(yán)重錯配堿基；trnA、trnE、trnF、trnE1氨基酸接受臂上各有一處嚴(yán)重錯配；trnD、trnG、trnT的TΨC臂缺失；trnL1、trnS2、trnW的TΨC環(huán)缺失。D環(huán)和TΨC環(huán)為3-11 bp，除trnD、trnE反密碼子環(huán)為11 bp外，其他反密碼子環(huán)均為9 bp。反義密碼子臂含4-5對堿基，而TΨC臂、D臂含2-4對堿基。木通紅喀木虱線粒體基因組的22個tRNA上共有37處堿基錯配。其中氨基酸接受臂上有14處錯配，D臂上有9處錯配，TΨC臂上有8處錯配，反密碼子臂上有6處。

2.2 基因重疊和間隔序列

將木通紅喀木虱線粒體基因組的基因間隔區(qū)和重疊區(qū)與木虱科的其他兩種木虱進(jìn)行比較（表5）。木通紅喀木虱線粒體基因組的間隔區(qū)最短為106 bp；脈斑銀木虱線粒體基因組的間隔區(qū)最長為164 bp。而脈斑銀木虱線粒體基因組的重疊區(qū)最短為45 bp；枸杞木虱線粒體基因組的重疊區(qū)最長為143 bp。

2.3 線粒體基因組的堿基組成

3種木虱線粒體基因組的堿基組成基本一致，木通紅喀木虱與枸杞木虱線粒體全基因的AT含量極接近均為70%左右，而脈斑銀木虱線粒體全基因的AT含量較多為73.78（表6）。3種木虱均有顯著的AT偏向。就線粒體基因而言，木通紅喀木虱的AT-Skew值為-0.31，GC-Skew值為0.18；枸杞木虱的AT-Skew值為-0.28，GC-Skew值為0.12；脈斑銀木虱的AT-Skew值為-0.30，GC-Skew值為0.10。

表3 木通紅喀木虱線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子及密碼子使用情況

表4 木通紅喀木虱線粒體基因組13個蛋白質(zhì)編碼基因編碼的氨基酸組成分析

2.4 非編碼區(qū)

由表6可知3種木虱線粒體基因組中非編碼區(qū)均位于rrnS和trnI之間，木通紅喀木虱、枸杞木虱和脈斑銀木虱非編碼區(qū)的長度分別為671 bp、744 bp和596 bp。

圖2 通紅喀木虱線粒體基因組rRNA基因

2.5 蛋白編碼基因

2.5.1 蛋白編碼基因的堿基組成 木通紅喀木虱、枸杞木虱和脈斑銀木虱3種木虱線粒體基因組中，蛋白質(zhì)編碼基因密碼子第1、2和3位點在J-鏈和N-鏈上所使用堿基的情況如圖4。

2.5.2 蛋白質(zhì)編碼基因推導(dǎo)的氨基酸組成分析 如表7，三種木虱線粒體基因組中蛋白質(zhì)氨基酸含量較高的前6位由高到低大致為亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、異亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）和纈氨酸（Val）此6種疏水性氨基酸。通過計算得出，在木通紅喀木虱食木虱、枸杞木虱和脈斑銀木虱中6種疏水氨基酸的含量之和分別達(dá)到59.14%、59.03%和58.95%。

2.5.3 蛋白質(zhì)編碼基因置換 由圖5可知，13個蛋白編碼基因之間的ω值差異顯著。

圖3 通紅喀木虱線粒體基因組rRNA基因

3 討論

木通紅喀木虱線粒體基因組共有14處重疊，總長度為100 bp，最大的重疊區(qū)域位于nad4和nad4L之間，長度為49 bp，最小的重疊區(qū)域有4處，均為1 bp。而基因間隔區(qū)數(shù)量為11處，總長度為106 bp，最大的間隔僅為28 bp，最小的間隔為1 bp。木通紅喀木虱全線粒體基因組的堿基偏向性十分明顯，其中堿基A的含量最高為38.16%，堿基T、C、G的含量分別為33.88%、17.95%和10.01%。蛋白質(zhì)編碼基因整體的A+T含量高于G+C含量。這一結(jié)果符合昆蟲線粒體基因組的堿基組成上的A-T偏向性。蛋白編碼基因的G、C堿基含量偏斜度低于A、T堿基，這與線粒體基因組整體的分析結(jié)果相反，蛋白質(zhì)編碼基因中堿基A與堿基T的含量上差值大于堿基G和堿基C含量差值。

表5 三種木虱線粒體基因組的基因重疊區(qū)和間隔區(qū)比較

表6 三種木虱線粒體基因組的堿基組成分析

表7 三種木虱線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因編碼的氨基酸組成

木通紅喀木虱的蛋白質(zhì)編碼基因以典型的ATN作為起始密碼子。ATA是最為常用的起始密碼子，cox2、ATP8、cox3、nad3、nad4L、nad6、cob 和nad1這8種蛋白編碼基因使用ATA作為起始密碼子。而以ATT作為起始密碼子的有2個nad5和nad2，其余3個CoxI、ATP6和nad4使用ATA為起始密碼子。13個蛋白質(zhì)基因中僅有2個基因未在基因3'端找到完全的終止密碼子。cox1、ATP8、ATP6、cox3、nad6、nad2此6個基因的終止密碼子為TAA。其余 5個基因 nad3、nad4、nad4L、Cob和 nad1以TAG為終止密碼子。2個基因CoxII和nad5沒有找到完整的終止密碼子，以T作為終止密碼子。而造成這種原因可能是該位置與其后的tRNA基因重疊，公用了幾個堿基。除這2個不完整地終止密碼子外，木通紅喀木虱的蛋白質(zhì)編碼基因共使用了3 530個密碼子。

圖5 三種木虱線粒體基因組中蛋白質(zhì)編碼基因的序列分化比較

三種木虱線粒體基因組的堿基組成基本一致，三者的AT偏斜均大于CG偏斜，且偏斜明顯。三種木虱的蛋白編碼基因密碼子第3位點的AT含量均明顯高于其他2個位點。

木通紅喀木虱、枸杞木虱和脈斑銀木虱三種木虱線粒體基因組中，分析可知三種木虱線粒體基因組上堿基組成基本相似，其中J-鏈上各堿基含量與N-鏈的各堿基含量大致相同。且除枸杞木虱N-鏈上第2位密碼子和脈斑銀木虱N-鏈上第3位密碼子外，其余所有密碼子位點的T含量均高于其它3種堿基的含量。三種木虱N鏈和J鏈上所有的密碼子位點的AT含量均高于GC含量。

根據(jù)3種木虱線粒體基因組中蛋白質(zhì)編碼基因的序列所推導(dǎo)得出的氨基酸組成情況可知其含量大致相同，且疏水氨基酸的大量出現(xiàn)，符合線粒體基因編碼的蛋白質(zhì)多為跨膜蛋白這一特性。由蛋白編碼基因之間的ω值差異顯著表明不同的基因所承受的選擇性壓力不同（若非同義/同義置換率的比率（ω=Ka/Ks）大于1，則說明蛋白質(zhì)編碼基因受到正選擇，若小于1，則說明其受到負(fù)選擇）。三種木虱mtDNA中J鏈上除nd6和cob基因外所有蛋白質(zhì)編碼基因的ω值大于1，表明這些基因在進(jìn)化過程中受到正選擇。N鏈上除nad4L外所有基因的ω值均小于1（nad4L基因的置換速率是其它值的3倍左右），說明N鏈大多基因受到負(fù)選擇作用。

4 結(jié)論

（1）木通紅喀木虱全線粒體基因組長度14 832 bp（NCBI登錄號為 NC_027087.1），A+T含量為72.04%。此線粒體基因組共編碼37個基因，包括13 個蛋白質(zhì)編碼基因、22個轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因，2個核糖體 RNA基因，這些基因的位置以及結(jié)構(gòu)都很保守。

（2）木通紅喀木虱的蛋白質(zhì)編碼基因以典型的ATN作為起始密碼子。ATA是最為常用的起始密碼子，此外還有ATT和ATA作為起始密碼子。6個基因的終止密碼子為TAA。5個基因以TAG為終止密碼子。2個基因沒有找到完整的終止密碼子，以T作為終止密碼子。木通紅喀木虱線粒體中使用率最高的6種密碼子依次為UUU（F）、UUA（L）、AUU（I）、UCU（S2）、UAU（Y） 和 AAU（N）。分析氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，Leu氨基酸編碼量遠(yuǎn)高于其他，為15.63%。其次Ser、Ile和Phe也很高，分別為10.83%、10.08%和9.89%。而Cys最低，僅為1.03%。

（3）木通紅喀木虱線粒體基因組上的兩個核糖體RNA基因（rrnL和rrnS）長度分別為1 153 bp和806 bp。木通紅喀木虱線粒體基因組上的22個tRNA基因僅有一個trnS1不能形成三葉草結(jié)構(gòu)。

（4）木虱科3種木虱枸杞木虱、木通紅喀木虱、脈斑銀木虱，37個基因以及非編碼區(qū)的排列順序完全相同，且三種木虱線粒體基因組的堿基組成基本一致，同時氨基酸的組成情況及含量也大致相同。