陳姣 ，鄧蕓 ，趙雁之 ，元芳秀 ，劉維鋒

(1、南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院眼科醫(yī)院，南昌 330006；2、江西省婦幼保健院兒?？?，南昌 330006)

糖尿病黃斑水腫（DME）是引起糖尿病患者視功能下降的主要病因。有研究表明，接受了視網(wǎng)膜激光光凝治療的DME患者中，有超過(guò)15%患者仍出現(xiàn)進(jìn)行性視力下降[1-3]。通常對(duì)該類患者進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物注射治療，從而降低其視網(wǎng)膜血管的通透性，有效減輕彌漫性黃斑水腫[4，5]。然而臨床工作中發(fā)現(xiàn)，接受過(guò)視網(wǎng)膜激光光凝治療的DME患者進(jìn)行玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子后對(duì)于黃斑水腫的緩解作用，顯著弱于未接受過(guò)視網(wǎng)膜激光光凝治療的DME患者[6]。由于貝伐單抗直接作用于眼部，其藥效的發(fā)揮與藥物在眼內(nèi)的濃度直接相關(guān)。由此，我們推測(cè)視網(wǎng)膜激光光凝治療可能影響抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物在眼內(nèi)的處置及濃度，從而影響藥效。為了證實(shí)這種推測(cè)，本研究將采用兔全視網(wǎng)膜激光光凝模型，通過(guò)在該模型下貝伐單抗的注射、樣本采集、濃度測(cè)定、藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以探討全視網(wǎng)膜激光光凝對(duì)眼內(nèi)貝伐單抗?jié)舛群捅┞读康挠绊?，為臨床全視網(wǎng)膜激光光凝后玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物的劑量調(diào)整提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 兔全視網(wǎng)膜激光光凝模型 選取灰兔18只（36 只眼），1.5kg-2.0kg，雌雄不限，由南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。肌肉注射戊巴比妥鈉麻醉兔，左眼用復(fù)方托吡咔胺眼液散瞳后，應(yīng)用間接眼底鏡532nm激光進(jìn)行全視網(wǎng)膜光凝，光斑為Ⅲ級(jí)光斑，功率為90-120mw，時(shí)間為0.1s，平均激光點(diǎn)數(shù)960±130；1h、1d、2d、4d、14d 及 30d 組別激光點(diǎn)數(shù)分別為 1090±81、984±189、938±124、1019±34、893±62、838±143，各時(shí)間段比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.75，P=0.19)。

1.2 玻璃體腔注射 視網(wǎng)膜激光光凝后2周雙眼進(jìn)行玻璃體腔注射。用1ml的注射器取0.05ml貝伐單抗，于兔眼上方角膜緣后2.5mm穿刺進(jìn)入玻璃體腔，將藥液注射入玻璃體腔內(nèi)，拔出針頭后局部用棉簽壓迫。術(shù)后左氧氟沙星滴眼液點(diǎn)眼。

1.3 樣本制作 貝伐單抗玻璃體腔注射后，分別于1h、1d、2d、4d、14d 及 30d 空氣栓塞處死 3 只兔子獲取6眼，取出眼球用生理鹽水沖洗，固定眼球，獲取玻璃體、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜樣本，直接保存于-80°的冰箱，直至樣本分析之前。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) （ELISA實(shí)驗(yàn)）做出貝伐單抗的標(biāo)準(zhǔn)曲線；將Recombinant Human VEGF165（1.0μg/ml 100μl）(R&D Systems，lnc)包被于酶標(biāo)板中，以備測(cè)定時(shí)使用；提前將樣本玻璃體、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜碾磨加工并稀釋好；酶標(biāo)板各反應(yīng)孔中加入稀釋樣品100μl，洗滌3次；酶標(biāo)板各反應(yīng)孔中加入辣根酶標(biāo)記山羊抗人IgG(中山金橋ZSGB．BIO)，2h后洗滌3次；酶標(biāo)板各反應(yīng)孔中加入顯色液A和顯色液B顯色并終止反應(yīng)；最后應(yīng)用酶標(biāo)儀（Rayto RT-6100酶標(biāo)分析儀）讀取玻璃體、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜樣本中吸光度值，計(jì)算得出貝伐單抗的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析t檢驗(yàn)對(duì)玻璃體、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜中不同時(shí)間段的貝伐單抗?jié)舛冗M(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算藥物曲線下面積（AUC）。

2 結(jié)果

2.1 玻璃體中貝伐單抗的平均藥物濃度在對(duì)照組和激光組 各時(shí)間點(diǎn)兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 詳見(jiàn)表 1。

2.2 在各組織不同時(shí)間點(diǎn)縱向比較中，均呈下降趨勢(shì)，但在激光組和對(duì)照組玻璃體中的濃度下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.25、15.79，P＜0.01）；而激光組和對(duì)照組視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜藥物濃度下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.03、0.65，F(xiàn)=0.99、0.66），表明藥物在玻璃體中的清除速率顯著高于視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜中。

2.3 通過(guò)計(jì)算藥物曲線下面積（AUC），發(fā)現(xiàn)藥物注射30d內(nèi)，貝伐單抗在對(duì)照組兔眼玻璃體中的暴露量 AUC30d 為 919.825μg/ml·d，顯著高于激光組兔眼玻璃體中的暴露量（732.285μg/ml·d），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04）。激光組和對(duì)照組兔眼視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜中的貝伐單抗暴露量AUC30d分別是729.115μg/ml·d、724.505μg/ml·d， 經(jīng)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P=0.58）。 見(jiàn)圖 1。

表1 激光組和對(duì)照組眼內(nèi)組織貝伐單抗?jié)舛葘?duì)比（μg/ml）

圖1 不同組織激光組和對(duì)照組貝伐單抗暴露量比較

3 討論

抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物廣泛應(yīng)用于眼科臨床，在不同的眼科疾病中發(fā)揮不同的作用。目前，在不同的眼部環(huán)境中藥物代謝動(dòng)力學(xué)是否會(huì)發(fā)生改變尚未明確。有學(xué)者對(duì)玻璃體切割術(shù)后玻璃體腔中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子清除率、雷珠單抗代謝清除率進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)其清除率均加快[7-9]；Chin[10]和Yang[11]進(jìn)行全視網(wǎng)膜激光光凝（PRP）與玻璃體腔注射貝伐單抗的治療，臨床效果明顯；而Pikkel[12]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療與PRP或者抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子注射單獨(dú)治療并未見(jiàn)明顯改善。因此，PRP是否會(huì)影響抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物在眼中的濃度和處置進(jìn)而影響其藥效，尚不明確。本研究以兔眼為模型，旨在研究PRP是否對(duì)貝伐單抗在兔眼中的處置和暴露量產(chǎn)生影響。

本研究結(jié)果表明，在抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子注射后第2d玻璃體貝伐單抗藥物濃度在對(duì)照組的含量比激光組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明視網(wǎng)膜激光可能在一定程度上加快藥物清除；這和臨床中激光組的療效降低相一致，揭示了臨床療效差異的潛在原因。提示臨床治療中，對(duì)于激光治療的患者，需要加大貝伐單抗的劑量。

多數(shù)學(xué)者研究認(rèn)為兔眼單抗的藥物半衰期為6d 左右[13，14]，且有效濃度能維持 3 個(gè)月[14]，這和本研究中貝伐單抗在30d內(nèi)的濃度分布相一致。在本研究中，貝伐單抗在兔眼注射后，快速達(dá)到峰值，然后以較高濃度維持在兔眼中，消除緩慢，在6d左右達(dá)到最大濃度的一半。但本研究只對(duì)30d內(nèi)兔貝伐單抗?jié)舛冗M(jìn)行檢測(cè)，關(guān)于30d后PRP對(duì)貝伐單抗在兔眼內(nèi)的分布和消除的影響，尚待進(jìn)一步研究。

本研究存在一定局限。兔眼模型與人眼有很多不同點(diǎn)：兔眼玻璃體腔小、晶狀體大、視網(wǎng)膜薄、且無(wú)血管化、無(wú)中心凹，有學(xué)者推測(cè)推測(cè)視網(wǎng)膜激光光凝治療可能引起血視網(wǎng)膜屏障的破壞[15，16]，因此兔眼PRP對(duì)藥物的影響與在人眼中相比，是否存在種屬差異，尚不明確，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。