用不同劑量的溴氰菊酯對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃對(duì)其腎細(xì)胞DNA的影響

石 微

（江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 222006）

溴氰菊酯（Deltamethrin，DM）屬于Ⅱ型擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑[1]。該殺蟲(chóng)劑具有觸殺迅速，擊倒能力強(qiáng)等特點(diǎn)。近年來(lái)，DM被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)作物蟲(chóng)害和公共衛(wèi)生蟲(chóng)害的防治中。有研究表明，DM可經(jīng)呼吸道、胃腸道及皮膚黏膜進(jìn)入人體[2]。隨著DM的廣泛應(yīng)用，眾多學(xué)者致力于研究DM對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響[3]。本主要探討使用不同劑量的溴氰菊酯對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃對(duì)其腎細(xì)胞DNA的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將40只健康清潔級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、橄欖油對(duì)照組、DM 1.563 mg/kg組、DM 3.125 mg/kg組和DM 6.250 mg/kg組，每組各有8只大鼠。本次研究中大鼠的體重為180～220 g，購(gòu)自青島實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑與儀器

1）溴氰菊酯（純度≥98%）購(gòu)自南京紅太陽(yáng)藥業(yè)。2）高碘酸、蘇木精購(gòu)自青島愛(ài)普科生物工程有限公司。3）瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司。4）Triton X-100非離子型表面活性劑。5）溴化乙錠熒光染色劑。6）乙二胺四乙酸絡(luò)合劑。7）德國(guó)SLEECUT5062型石蠟切片機(jī)。8）德國(guó)SLEES2052/22型全自動(dòng)脫水機(jī)。9）電泳儀。10）熒光顯微鏡。

1.3 灌胃方法

進(jìn)行灌胃的方法是：1）將這五組大鼠分別放置在24 h自然光照的試驗(yàn)室中進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。飼養(yǎng)的時(shí)間為1周。將試驗(yàn)室的溫度設(shè)置為15～25℃。在此期間，所有大鼠均自由飲水和進(jìn)食。2）從第8 d開(kāi)始，每日上午9點(diǎn)對(duì)這五組大鼠進(jìn)行灌胃。為空白對(duì)照組大鼠使用5 ml/kg-1·d-1的生理鹽水進(jìn)行灌胃，為橄欖油對(duì)照組大鼠使用5 ml/kg-1·d-1的橄欖油進(jìn)行灌胃，為DM 1.563 mg/kg組大鼠使用小劑量的溴氰菊酯（1.563 mg/kg-1·d-1）和5 ml/kg-1·d-1的橄欖油混合液進(jìn)行灌胃，為DM 3.125 mg/kg組大鼠使用中等劑量的溴氰菊酯（3.125 mg/kg-1·d-1）和5 ml/kg-1·d-1的橄欖油混合液進(jìn)行灌胃，為DM 6.250 mg/kg組大鼠使用大劑量的溴氰菊酯（6.250 mg/kg-1·d-1）和5 ml/kg-1·d-1的橄欖油混合液進(jìn)行灌胃。1次/d。每灌胃5 d，停止灌胃2 d。連續(xù)灌胃24周。3）最后一次灌胃后，大鼠禁食24 h。4）對(duì)大鼠進(jìn)行水合氯醛腹腔麻醉。5）將大鼠放在冰盤(pán)上，迅速對(duì)其進(jìn)行解剖，并取出其腎臟。6）用預(yù)冷的去離子水對(duì)大鼠的腎臟進(jìn)行沖洗。

1.4 檢測(cè)方法

采用石蠟切片技術(shù)與HE染色法檢測(cè)大鼠腎組織結(jié)構(gòu)的變化。檢測(cè)的方法是：1）用濃度為4%的多聚甲醛對(duì)大鼠的腎組織進(jìn)行固定。2）用石蠟包埋大鼠的腎組織，并使用切片機(jī)對(duì)包埋后的腎組織進(jìn)行切片，切片的厚度為5 um。3）使用蘇木精對(duì)腎組織切片進(jìn)行染色，染色的時(shí)間為10 min，然后，用自來(lái)水沖洗腎組織切片1 min。4）使用濃度為1%的鹽酸乙醇對(duì)腎組織切片進(jìn)行分化，分化的時(shí)間為30 秒，然后，用自來(lái)水沖洗腎組織切片1 min。5）使用濃度為1%的氨水對(duì)腎組織切片進(jìn)行返藍(lán)，返藍(lán)的時(shí)間為30 秒，然后，用自來(lái)水沖洗腎組織切片1 min。6）使用濃度為95%的伊紅對(duì)腎組織切片進(jìn)行染色，染色的時(shí)間為5 min，然后，用自來(lái)水沖洗腎組織切片3～5秒。7）將腎組織切片放置在溫度為37℃的烘干機(jī)中進(jìn)行烘干，然后，用中性樹(shù)膠進(jìn)行封固。采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)大鼠腎細(xì)胞尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩[4]。檢測(cè)的方法是：1）將大鼠的腎臟剪成細(xì)碎的糜狀，并用200目篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，用拋光后的吸管輕輕吹打，使其成為細(xì)胞懸液。2）對(duì)過(guò)濾后的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心處理，離心的轉(zhuǎn)速為800 rpm，離心的時(shí)間為5 min。然后，去除上清液。3）使用PBS溶液將大鼠腎細(xì)胞的濃度調(diào)整為104～105個(gè)/ml。4）對(duì)大鼠的腎細(xì)胞進(jìn)行制片、避光裂解、解螺旋、電泳、中和及染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS17.0軟件對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)五組大鼠腎組織病理切片進(jìn)行HE染色情況的分析

在進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組大鼠和橄欖油對(duì)照組大鼠腎小球的大小正常，其腎小管上皮細(xì)胞未出現(xiàn)水腫，其腎小球內(nèi)足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞的形態(tài)均正常。DM 1.56 mg/kg組大鼠和DM 3.125 mg/kg組大鼠部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，其部分腎小球毛細(xì)血管出現(xiàn)擴(kuò)張，其部分腎小球系膜細(xì)胞出現(xiàn)增生。DM6.25 mg/kg組大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，其腎小球毛細(xì)血管出現(xiàn)較為嚴(yán)重的擴(kuò)張，其腎小球系膜細(xì)胞出現(xiàn)增生。

2.2 五組大鼠腎細(xì)胞DNA損傷程度的比較

在熒光顯微鏡下，未受損的腎細(xì)胞DNA以圓形熒光為核心，無(wú)明顯的尾部或尾部很短，受損的腎細(xì)胞DNA呈彗星狀，尾部由DNA 破裂斷片組成。在本次試驗(yàn)中，DM 1.563 mg/kg組大鼠、DM 3.125 mg/kg 組大鼠和DM 6.250 mg/kg組大鼠腎細(xì)胞尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩均高于空白對(duì)照組大鼠，P＜0.05 。與DM 1.563 mg/kg組大鼠、DM 3.125 mg/kg 組大鼠相比，DM 6.250 mg/kg組大鼠腎細(xì)胞尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩均更高，P＜0.05。詳情見(jiàn)表1。

表1 五組大鼠腎細(xì)胞DNA損傷程度的比較（）

表1 五組大鼠腎細(xì)胞DNA損傷程度的比較（）

注：②③與空白對(duì)照組相比，P＜0.05；①與空白對(duì)照組相比，P＞0.05；②與DM 6.250 mg/kg組相比，P＜0.05。

組別 尾DNA含量（%）尾矩 Olive尾矩空白對(duì)照組 1.45 ±1.79 0.16±0.33 0.38±0.46橄欖油對(duì)照組 1.57 ±1.82① 0.18±0.23① 0.49±0.37①DM 1.563 mg/kg組 23.18±4.66② 11.31±4.54② 22.12±4.69②DM 3.125 mg/kg組 24.12±6.92② 12.01±6.97② 23.06±7.03②DM 6.250 mg/kg組 38.18±9.53③ 39.04±9.92③ 29.12±5.69③

3 討論

DM屬于Ⅱ型擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑。該殺蟲(chóng)劑進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，可迅速擴(kuò)散至其體內(nèi)的各個(gè)器官，經(jīng)肝臟代謝后，由腎臟排出。在進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)，DM 1.56 mg/kg組大鼠和DM 3.125 mg/kg組大鼠部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，其部分腎小球毛細(xì)血管出現(xiàn)擴(kuò)張，其部分腎小球系膜細(xì)胞出現(xiàn)增生。DM6.25 mg/kg組大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，其腎小球毛細(xì)血管出現(xiàn)較為嚴(yán)重的擴(kuò)張，其腎小球系膜細(xì)胞出現(xiàn)增生。這說(shuō)明，DM所致慢性蓄積中毒可使大鼠的腎組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。DM的用量與大鼠腎組織結(jié)構(gòu)的變化呈正相關(guān)。單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)是一種測(cè)定單個(gè)DNA損傷的方法。該檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)[4]。本次研究的結(jié)果證明，使用不同劑量的溴氰菊酯對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃可使其腎細(xì)胞DNA受到損傷。DM的用量與大鼠腎細(xì)胞DNA損傷的程度呈正相關(guān)。