對缺血性再灌注腦損傷大鼠采用鹽酸托哌酮聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)行治療的效果探討

李俊雅，李 君

(湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)技學(xué)院，湖南 湘潭 411102）

腦梗死是由于患者大腦缺血、缺氧所致。腦梗死患者的大腦若長時間缺血可發(fā)生神經(jīng)功能障礙，可對其生命造成威脅。因此，對腦梗死患者采用一種有效、快速的方法恢復(fù)其腦缺血區(qū)域的血液供應(yīng)具有重要意義[1-2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs）可在適宜的條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞，可用這種干細(xì)胞改善腦梗死患者的病情[3-4]。鹽酸托哌酮可直接擴張腦梗死患者血管的平滑肌，抑制其發(fā)生多突觸反射，降低其骨骼肌的張力，進(jìn)而使其腦部的血流量增加。鹽酸托哌酮是臨床上治療高血壓、心絞痛、短暫性腦缺血及腦梗死等心腦血管疾病的常用藥[5]。有研究資料顯示，對缺血性腦損傷患者采用鹽酸托哌酮聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)行治療的效果很好。在本次研究中，筆者主要探討對缺血性再灌注腦損傷大鼠采用鹽酸托哌酮聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)行治療的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供的48只健康雄性大鼠作為研究對象。這48只大鼠的年齡均為3～4個月，其體重為250～330 g，其動物合格證號為：SCXK（湘）2015-0412。將這些研究對象隨機分為模型組、干細(xì)胞移植組、鹽酸托哌酮組及聯(lián)合治療組，每組各有12只大鼠。四組大鼠的一般資料相比，P＞0.05，具有可比性。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗用的主要儀器與試劑本次實驗使用的主要儀器與試劑包括：血管內(nèi)皮生長因子免疫組化試劑盒（生產(chǎn)廠家：北京博奧森生物技術(shù)公司）；氯化三苯基四唑氮（TTC）（生產(chǎn)廠家：廣州威佳科技有限公司）；鹽酸托哌酮片（生產(chǎn)廠家：江蘇中興藥業(yè)有限公司）。

1.2.2 動物模型的制作采用線栓法（Longa）建立大鼠腦缺血性再灌注腦損傷模型（Middle cerebral artery occlusion MCAO）[6-7]。具體建模的方法為：對大鼠進(jìn)行全麻。結(jié)扎大鼠右側(cè)近心端的頸總動脈,將其遠(yuǎn)心端的頸總動脈夾閉，將其頸總動脈剪一小口，經(jīng)其頸總動脈和頸內(nèi)動脈插入線栓。等待1 h后，在大鼠麻醉的狀態(tài)下完全拔出線栓，并結(jié)扎其頸內(nèi)動脈的遠(yuǎn)心端。建模成功的標(biāo)準(zhǔn)為[6]：在大鼠蘇醒后，將其尾巴提起，其左側(cè)前肢呈內(nèi)收屈曲狀。大鼠向左劃圈爬行，其在站立時向左側(cè)傾倒。大鼠的瞳孔縮小、眼瞼下垂、眼裂狹小、眼球內(nèi)陷及患側(cè)額部無汗。建模失敗的標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠無神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)或完全不能行走。若有需要排除的大鼠，應(yīng)隨機補足大鼠的數(shù)目。

1.2.3 治療方法對模型組大鼠不使用任何方法進(jìn)行治療，并讓其自由飲食。在建模24 h后，對干細(xì)胞移植組大鼠采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)行治療。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的方法為：使用大鼠立體定向儀為大鼠注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并讓其自由飲食。在建模24 h后，對鹽酸托哌酮組大鼠使用鹽酸托哌酮進(jìn)行治療。鹽酸托哌酮的用法為：灌胃，1.5 g/kg，1次/d。在建模24 h后，對聯(lián)合治療組大鼠用鹽酸托哌酮聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)行治療。鹽酸托哌酮的用法與鹽酸托哌酮組大鼠。進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的方法與干細(xì)胞移植組大鼠的使用方法相同。

1.2.4 計算各組大鼠CD34陽性細(xì)胞數(shù)的方法采用 CD34多克隆抗體免疫組化染色后，觀察大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中染成棕黃色或淺棕色顆粒的沉著情況，在高倍鏡視野下(×400倍)在其紋狀體區(qū)中隨機選擇5 個不重復(fù)的視野，在這5個視野中計算其陽性細(xì)胞的總數(shù)，然后將陽性細(xì)胞的總數(shù)除以5求得平均數(shù)。

1.2.5 觀察大鼠腦梗死體積的方法將大鼠進(jìn)行麻醉,從其背面剪下其頭部并取出其大腦,將其大腦沖洗后在-20℃的環(huán)境中快速冷凍30 min。然后，在大鼠腦前極與視交叉連線中點處、漏斗柄與尾極之間, 每隔2 mm做連續(xù)冠狀切片,并將其置于濃度為2%的TTC緩沖液中,在37℃避光水浴孵育20～30 min。正常大鼠的腦組織為深紅色，缺血性再灌注腦損傷大鼠的腦組織不著色。

1.3 觀察指標(biāo)

在接受治療后的第3 d及第7 d，觀察各組大鼠神經(jīng)功能缺損的評分、CD34陽性細(xì)胞數(shù)及腦梗死的體積。根據(jù)文獻(xiàn)[8]介紹的方法，用神經(jīng)功能缺損評分表評估大鼠神經(jīng)功能的缺損程度，評估表的內(nèi)容包括大鼠向患側(cè)旋轉(zhuǎn)、前爪的抓力及爬桿的能力3項。每1項的總評分為4分，評估表的總評分為12分，評分越高表明其神經(jīng)功能缺損的程度越嚴(yán)重。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

對本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 接受治療后四組大鼠神經(jīng)功能評分的對比

接受治療后的第3 d及第7 d，與模型組大鼠相比，干細(xì)胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠神經(jīng)功能缺損的評分均較低（P＜0.05）。與接受治療后的第3 d相比，在治療后的第7 d干細(xì)胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠神經(jīng)功能缺損的評分均較低（P＜0.05）。在接受治療后的第3 d及第7 d，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損的評分相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 接受治療后四組大鼠神經(jīng)功能評分的對比(分，±s)

表1 接受治療后四組大鼠神經(jīng)功能評分的對比(分，±s)

*與模型組相比，P＜0.05；#與接受治療的3 d相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) 3d 7d模型組 12 9.48±0.66 9.42±1.63干細(xì)胞移植組 12 7.48±1.12* 4.35±1.13*#鹽酸托哌酮組 12 7.35±1.04* 4.50±1.31*#聯(lián)合治療組 12 6.18±1.13* 3.02±0.76*#

2.2 接受治療后四組大鼠CD34陽性細(xì)胞數(shù)的比較

接受治療后的第3 d及第7 d，與模型組大鼠相比，干細(xì)胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠的CD34陽性細(xì)胞數(shù)均較高（P＜0.05）。與接受治療后的第3 d相比，在治療后的第7 d干細(xì)胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠的CD34陽性細(xì)胞數(shù)均較高（P＜0.05）。在接受治療后的第3 d及第7 d，模型組大鼠的CD34陽性細(xì)胞數(shù)相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2及圖1～4。

表2 接受治療后四組大鼠CD34陽性細(xì)胞數(shù)的比較(個，±s)

表2 接受治療后四組大鼠CD34陽性細(xì)胞數(shù)的比較(個，±s)

*與模型組相比，P＜0.05；#與接受治療后3 d相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) 3 d 7 d模型組 12 14.88±1.46 15.33±2.01移植組 12 22.02±1.58* 26.82±2.21*鹽酸托哌酮組 12 23.01±2.32* 26.59±1.85*聯(lián)合治療組 12 26.45±2.24* 35.12±1.69*#

圖1 治療后7 d模型組大鼠CD34陽性細(xì)胞分布情況

圖2 治療后7 d移植組大鼠CD34陽性細(xì)胞分布情況

圖3 治療后7 d鹽酸托哌酮組患者CD34陽性細(xì)胞分布情況

圖4 治療后7 d聯(lián)合治療組患者CD34陽性細(xì)胞分布情況

2.3 接受治療后四組大鼠腦梗死體積的比較

接受治療后的第3 d及第7 d，與模型組大鼠相比，干細(xì)胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠腦梗死的體積均較?。≒＜0.05）。與接受治療后的第3 d相比，在治療后的第7 d干細(xì)胞移植組大鼠、鹽酸托哌酮組大鼠及聯(lián)合治療組大鼠腦梗死的體積均較?。≒＜0.05）。在接受治療后的第3 d及第7 d，模型組大鼠腦梗死的體積相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 接受治療后四組大鼠腦梗死體積的比較(%，±s)

表3 接受治療后四組大鼠腦梗死體積的比較(%，±s)

*與模型組相比，P＜0.05；#與接受治療后3 d相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) 3d 7d模型組 12 35.66±1.25 35.69±2.28#移植組 12 30.10±1.27* 19.48±2.21*#鹽酸托哌酮組 12 30.80±0.98* 18.57±0.78*#聯(lián)合治療組 12 26.25±1.30* 12.22±1.07*#

3 討論

患者罹患腦梗死后，其大腦可發(fā)生血管內(nèi)皮損傷及血液循環(huán)減少。使腦部血管再生是對腦梗死患者進(jìn)行治療的目的之一。腦梗死患者的腦部血管再生后，可保護其腦部缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元及內(nèi)皮細(xì)胞，并清除其壞死的腦組織[9-11]。CD34是臨床上常用的反映血管新生的標(biāo)志物。該細(xì)胞具有誘導(dǎo)患者腦缺血處血管再生的作用[12-14]。有資料顯示，在腦部新生血管內(nèi)皮中CD34的陽性表達(dá)大于腦部非新生血管內(nèi)皮中CD34的陽性表達(dá)。由此可說明，大腦中CD34陽性細(xì)胞數(shù)的增加與血管新生有關(guān)[15]。本次研究的結(jié)果證實，對缺血性再灌注腦損傷大鼠采用鹽酸托哌酮聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)行治療的效果顯著，可促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)，減小其腦梗死的體積。