葛春艷， 李雪彤， 劉福鵬， 鄭大浩， 吳委林

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002； 2.長春科技學(xué)院，吉林長春 130600)

紅景天(Rhodiolarosea)為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)珍稀藥用植物，具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗缺氧、抗疲勞、抗病毒、抗腫瘤、抗應(yīng)激反應(yīng)、增強機體免疫力、改善心血管系統(tǒng)功能等藥理作用，廣泛應(yīng)用于軍事、航天、醫(yī)藥、功能性食品、化妝品等保健和臨床方面[1-4]。目前，相關(guān)研究主要關(guān)注紅景天形態(tài)特性、栽培措施、紅景天苷的生物合成以及藥理與藥性方面，未見關(guān)于其花器官發(fā)育等方面的相關(guān)研究。研究者依據(jù)大量花發(fā)育的研究結(jié)果提出ABCE模型，其中C+E基因控制雌蕊發(fā)育，而C組基因中的AG基因的弱突變體為心皮發(fā)育缺陷但雄蕊的發(fā)育正常，說明雄蕊和心皮屬性的確定與發(fā)育對AG基因表達(dá)水平的要求不同[5]。

電子克隆(insilicocloning)技術(shù)是近幾年來新發(fā)展的一種新的基因快速克隆方法，基本原理是基于已建立的核酸序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，利用計算機技術(shù)與生物信息學(xué)工具進(jìn)行比對、拼接及分析而快速獲得相應(yīng)的功能基因。該技術(shù)具有高效率、低成本且針對性強等優(yōu)點[6]，已被研究者們在基因克隆之前廣泛使用。但是，當(dāng)前研究者基本以已知相關(guān)物種的EST(expressed sequence tags，表達(dá)序列標(biāo)簽)序列在基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行反復(fù)比對、拼接到?jīng)]有可供延長的序列為止，得到最終的重疊群(Contig)，再進(jìn)行開放閱讀框的查找及后續(xù)相關(guān)生物信息學(xué)分析。隨著測序技術(shù)與生物信息軟件的發(fā)展，已有大量已拼接好的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，本研究將擬南芥AG基因在紅景天轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，得到紅景天全長AG基因，減少了反復(fù)比對與拼接的麻煩以及可能出現(xiàn)的錯誤，并對其進(jìn)行相應(yīng)的生物信息學(xué)分析，以期為后續(xù)相關(guān)功能基因的克隆與功能分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 電子克隆獲得紅景天AG基因序列

將擬南芥AG基因(NP_001190766.1)在中國國家基因數(shù)據(jù)庫(https：//db.cngb.org/blast/blastn/)中選擇tblastn程序在紅景天轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，將比對得到的多條序列逐一通過BLAST軟件進(jìn)行在線比對分析與Amigo(http：//amigo1.geneontology.org/cgi-bin/amigo/blast.c-gi)注釋分析，最終確定紅景天AG基因(Rhodiola rosea AGAMOUS，簡稱RrAG)。

1.2 生物信息學(xué)分析

(1)將已得到的RrAG基因的mRNA序列利用SeqBuilder軟件分析開放閱讀框(open reading frame，簡稱ORF)與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站的CD-search(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線分析其編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(conserved domains)。

(2)用Protparam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的一級結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)；用HMMTOP(http：//www.enzim.hu/hmmtop/)、TMpred Server(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)與TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；用SignalP 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號肽預(yù)測；用TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進(jìn)行導(dǎo)肽分析；用Protfun 2.2 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)預(yù)測蛋白質(zhì)功能；利用在線軟件PSORT(http：//psort.hgc.jp/form.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

(3)用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB網(wǎng)站的3D Structure Viewers在線可視化工具(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do#Category-visualize)預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)。用NetPhos(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測磷酸化位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天AG基因序列的獲得及序列分析

將擬南芥AG基因(登錄號：NP_001190766.1)序列作為參考序列，在中國國家基因數(shù)據(jù)庫的千種植物數(shù)據(jù)庫(https：//db.cngb.org/blast4onekp/blast)中通過選擇tBLASTn程序[Expectation Value(期望值，簡稱E值)<0.001]，在紅景天轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，得到相似度較高的16條序列，并利用BLAST在線軟件分析了每條相似序列，最終確定了每條序列的基因功能。表1的結(jié)果表明，僅ZJUL-2061267為AG基因，通過在線Amigo進(jìn)行注釋分析，進(jìn)一步說明ZJUL-2061267為紅景天的AG基因(RrAG)。

使用SeqBuilder軟件分析可知，ZJUL-2061267基因全長為1 037 bp，含有789 bp的開放閱讀框，編碼262個氨基酸(圖1)。經(jīng)NCBI網(wǎng)站CCD在線預(yù)測表明，該基因包含MADS_MEF2_like(MADS家族，登錄號：cd00265)與K-box(登錄號：pfam01486)結(jié)構(gòu)域(圖2)，這2個區(qū)域?qū)χ参锏男螒B(tài)建成具有重要作用。

表1 用NP_001190766.1在千種植物數(shù)據(jù)庫比對得到的顯著相似性序列及基因

2.2 紅景天AG基因編碼氨基酸理化性質(zhì)及一級結(jié)構(gòu)預(yù)測

基于ExPASy網(wǎng)站蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，利用ProtParam預(yù)測ZJUL-2061267蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，該蛋白含有262個氨基酸，分子式為C1 284H2 077N383O420S9，分子質(zhì)量(MW)為29 888.47 u，由19種氨基酸組成(表2)。其中，絲氨酸(Ser，簡稱S)數(shù)量最多，達(dá)到11.8%，其次是亮氨酸(Leu，簡稱L)與谷氨酰胺(Gln，簡稱Q)，分別達(dá)到8.4%與8.0%，而不含有色氨酸(Trp，簡稱W)、吡咯賴氨酸(Pyl，簡稱O)、硒半胱氨酸(Sec，簡稱U)、天冬氨酸(Asx，簡稱B)、谷氨酰胺(Glx，簡稱Z)與任意氨基酸殘基(Xaa，簡稱X)。該蛋白理論等電點(pI)為9.27，帶負(fù)電荷殘基數(shù)為30個，帶正電荷殘基數(shù)為38個，親水性平均系數(shù)(GRAVY值)為-0.851，說明該蛋白屬于親水性蛋白；理論推導(dǎo)半衰期是30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為56.28(>40)，說明該蛋白不穩(wěn)定(表3)。

2.3 紅景天AG基因編碼蛋白跨膜分析及信號肽與功能預(yù)測

使用在線軟件HMMTOP、TMpred Server與TMHMM Server v.2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，由圖3、圖4可以看出，該基因編碼蛋白為無跨膜區(qū)的膜外蛋白，說明該蛋白為水溶性蛋白，不與膜的疏水部分直接作用；通過在線軟件SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號肽預(yù)測表明，該基因無信號肽；通過TagetP 1.1 Server進(jìn)行預(yù)測顯示，該蛋白為葉綠體轉(zhuǎn)運蛋白(cTP)、線粒體靶向蛋白(mTP)、信號肽的可能性均較小，概率分別僅為0.332、0.103與0.026，而其他蛋白(other)的概率卻達(dá)到了0.738，預(yù)示其為非分泌蛋白。使用Protfun 2.2 Server分析其蛋白功能，由表4可以看出，其中僅轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(transcription_regulation)、轉(zhuǎn)錄(transcription)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal_transducer)概率大于0.05(P>0.05)，分別為0.107、0.079與0.075，說明該蛋白主要起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。此外，在Predictprotein網(wǎng)站進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測，表明其定位于細(xì)胞核內(nèi)。綜合以上分析，推測該蛋白為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

2.4 紅景天AG基因二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是其活性與功能的重要影響因素之一[7-9]。編碼的氨基酸借助氫鍵作用呈現(xiàn)的線性排列形成線性的二級結(jié)構(gòu)，再由范德華力、氫鍵等相互作用使其進(jìn)一步折疊形成立體的三級結(jié)構(gòu)。通過使用SOPMA預(yù)測紅景天AG基因的二級結(jié)構(gòu)表明，紅景天AG基因編碼的蛋白由α-螺旋、無規(guī)則卷曲與延伸鏈構(gòu)成，其中α-螺旋、無規(guī)則卷曲占氨基酸總數(shù)的比例較大，分別占48.09%、40.84%，而延伸鏈僅占11.07%(表5)。圖5更為直觀地表明，RrAG基因編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋與無規(guī)則卷曲所占比例較延伸鏈高。

利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB網(wǎng)站的3D Structure Viewers在線可視化工具預(yù)測紅景天AG基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)得到三維結(jié)構(gòu)。從圖6可以直觀地看出，紅景天AG基因編碼的蛋白屬于MADS-box家族，在第3～57位氨基酸處存在MADS-box結(jié)構(gòu)域，在第58～86位氨基酸處存在Mef2-type功能域結(jié)合DNA，并啟動(調(diào)控)下游基因的轉(zhuǎn)錄。

2.5 蛋白質(zhì)磷酸化位點分析

蛋白質(zhì)翻譯后的修飾也是其活性的重要影響因素之一，如磷酸化、精氨酸甲基化、糖基化等，其中磷酸化是重要的共價修飾方式之一。通過使用NetPhos(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測紅景天AG基因編碼蛋白的磷酸化位點。由圖7可以看出，該蛋白的蛋白激酶磷酸化位點有36個，分別是21個絲氨酸、8個蘇氨酸(Thr)、7個酪氨酸(Tyr)。

2.6 紅景天AG基因的結(jié)構(gòu)域與親緣進(jìn)化關(guān)系分析

將RrAG基因蛋白序列在NCBI中進(jìn)行比對(BLASTp)，下載相似性較高的AG蛋白序列，并使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對。圖8結(jié)果顯示，在MADS-box與K-box 2個保守結(jié)構(gòu)域上，該基因編碼蛋白與其他物種的AG蛋白具有較高的相似度。利用MegAlign與MEGA6.06軟件構(gòu)建紅景天AG(登錄號：ZJUL-2061267)與麻風(fēng)樹AG(登錄號：NP_001292936.1)、八仙花AG(登錄號：BAG74745.1)、橡膠樹AG(登錄號：XP_021662672.1)、茶樹AG(登錄號：AID22158.1)、木薯AG(登錄號：XP_021596031.1、XP_021599035.1)、甜椒AG(登錄號：NP_001311689.1)、砂梨AG(登錄號：AJW29028.1、AJW29030.1)、蘋果AG(登錄號：NP_001315863.1)、黑櫻桃木AG(登錄號：ACH72974.1)、棣棠花AG(登錄號：AGZ01978.1)、櫻桃AG(登錄號：AIU94283.1)、蕎麥AG(登錄號：AFO83615.1)、薔薇AG(登錄號：AAD00025.1)、煙草AG(登錄號：NP_001312829.1)、葡萄AG(登錄號：NP_001268097.1、AEG19542.1)、陸地棉AG(登錄號：NP_001314177.1、AAL92522.1)、亞洲棉AG(登錄號：KHG12869.1)、黑白蠟?zāi)続G(登錄號：APJ35634.1)、黃金樹AG(登錄號：AJZ73175.1)、板栗AG(登錄號：AAZ77747.1)等植物AG同源蛋白氨基酸序列進(jìn)化樹，由圖9可以看出，RrAG(登錄號：ZJUL-2061267)與蕎麥AG(登錄號：AFO83615.1)的蛋白序列相似性最高。

表2 ZJUL-2061267編碼蛋白的氨基酸組成

3 討論與結(jié)論

目前，由于紅景天的藥用價值已經(jīng)被人們普遍認(rèn)識到，其需求量正在逐年增加，其所屬植物的人工栽培也在全國較多地區(qū)得到了較大面積的開展。張雪蓮分析發(fā)現(xiàn)，從對高山紅景天的重要藥用成分紅景天苷的分析中發(fā)現(xiàn)，雄性植株的含量明顯高于雌性植株[10]，因此，研究紅景天花器官發(fā)育對于單性植株育種具有重要意義?；趯M南芥等大量植物花發(fā)育同源異型突變體的研究結(jié)果，本研究闡釋了4類花器官同源異型基因決定花器官特征屬性(花器官發(fā)育的ABCE模型)，其中C+E功能基因控制雌蕊發(fā)育[11]。AG基因?qū)儆贛ADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族，是迄今為止花器官發(fā)育中唯一的C類基因，起到花器官形態(tài)建成中調(diào)控雄蕊與雌蕊發(fā)育的作用。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，電子克隆技術(shù)(in silico cloning)已經(jīng)成為克隆基因簡便、快捷的新方法。目前，人們以EST為探針，通過比對基因組數(shù)據(jù)庫，結(jié)合生物信息學(xué)對基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測及分析，已成功從高叢越橘(UFGT基因)[12]、甘蔗(Sckn1基因)[13]、辣椒(actin基因)[14]、高粱(SAMDC基因)[15]、小麥(Cyp450基因)[16]等植物中獲得了新基因。

表3 ZJUL-2061267編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測

表4 ZJUL-2061267的主要功能預(yù)測

表5 RrAG的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

本研究基于紅景天轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過電子克隆技術(shù)獲得了紅景天AG基因，生物信息分析及預(yù)測表明，該基因全長1 037 bp，包含1個長度為789 bp的開放閱讀框，編碼262個氨基酸，有MADS_MEF2_like與K-box結(jié)構(gòu)域，該蛋白為無跨膜區(qū)的定位于細(xì)胞核內(nèi)的不穩(wěn)定水溶性蛋白，為參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，有21個絲氨酸、8個蘇氨酸、7個酪氨酸為磷酸化位點，該蛋白與蕎麥的AG蛋白親緣關(guān)系最近。本研究結(jié)果為景天科植物的AG基因的克隆與功能研究等方面的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。同時，本研究采用基于轉(zhuǎn)錄組的電子克隆也為未來的電子克隆技術(shù)的應(yīng)用提供了參考。