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      殼聚糖的定向修飾及其衍生物性能研究

      2018-12-06 13:21:06代茹楠張彥璐陳建澍應(yīng)國清
      浙江化工 2018年11期
      關(guān)鍵詞:苯甲?;?/a>甲酰

      易 喻,代茹楠,張彥璐,陳建澍,應(yīng)國清*

      (浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

      天然殼聚糖是一種高分子量的直鏈多糖,由β-(1-4)-2-乙酰胺基-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖和 β-(1-4)-2-氨基-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖交替結(jié)合而成,在自然界中非常豐富,是昆蟲和甲殼類動物外骨骼的組成成分[1]。殼聚糖無毒害[2],擁有良好的生物降解能力[3],生物相容性[4],無抗原性[5],抑菌性[6]和促進傷口愈合的能力[7-8]。殼聚糖在農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護、制藥、醫(yī)學(xué)以及食品工業(yè)上都有廣泛的應(yīng)用[9-10]。然而由于殼聚糖只能溶于pH=6.5以下的酸性水溶液中 (如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸等)[11],因此相關(guān)的應(yīng)用受到了很大的限制。殼聚糖本身的剛性結(jié)構(gòu)和分子內(nèi)強烈的氫鍵作用是導(dǎo)致其水溶性差的主要原因,改善殼聚糖的水溶性通常有三種途徑:①控制殼聚糖的脫乙酰度[12-13],對高脫乙酰度高的殼聚糖進行?;磻?yīng),破壞殼聚糖原有致密晶體結(jié)構(gòu),使其脫乙酰度(DD)控制在50%左右;②將殼聚糖在適當條件下降解為低分子量(<5000 D)的水溶產(chǎn)物[14]。③ 利用殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的羥基和氨基的反應(yīng)活性,在其分子鏈上引入親水基團,并破壞分子內(nèi)的氫鍵作用。?;痆15]、季胺化[16]、羧甲基化[17]均能削弱分子內(nèi)氫鍵從而增加了殼聚糖的水溶性。已有的研究和實踐已獲得一些階段性的結(jié)果[18-20],但還有些問題值得進一步研究,如-OH和-NH2,哪個是改善水溶性的關(guān)鍵等。

      因此,本論文利用不同的反應(yīng)原理定向在殼聚糖的-OH或者-NH2上修飾上同樣的疏水基團苯甲酰基),表征后研究N-苯甲酰殼聚糖和O-苯甲酰殼聚糖之間的溶解性的差異,分析差異產(chǎn)生的原因。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      殼聚糖(DD ≥ 90%,MW=205 kD)(浙江澳興生物技術(shù)有限公司)、苯甲酰氯(上海生物化工有限公司)。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 N-苯甲酰殼聚糖的制備

      在室溫下,將1.0 g殼聚糖溶于45 mL 0.2 mol/L的HCl水溶液,然后加入15 mL丙酮,攪拌15 min,向上述溶液加入2 mL吡啶,繼續(xù)攪拌15 min。將2.0 e.q.-NH2的苯甲酰氯溶于15 mL丙酮,用恒壓滴定漏斗緩慢滴加到殼聚糖的HCl/丙酮/吡啶混合溶液中,50℃攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后將溶液傾倒入400 mL丙酮中得到沉淀,抽濾得到固體,固體再用丙酮和無水乙醇洗滌3~5次,加30 mL水溶解后放入透析袋中透析3~5 d,凍干后得到N-苯甲酰殼聚糖。

      圖1 N-苯甲酰殼聚糖1的合成路線

      1.2.2 O-苯甲酰殼聚糖的制備

      在室溫下,1.0 g殼聚糖溶于15 mL甲磺酸中,攪拌15 min至完全溶解,之后將上述溶液放置于0℃冰浴,待溶液的溫度達到冰浴溫度后,向反應(yīng)液中一邊攪拌一邊緩慢滴加苯甲酰氯,手工攪拌1 h后于室溫下攪拌反應(yīng)3 h,最后放置于-20℃冰箱過夜。次日取出反應(yīng)液,放于室溫使之融解,立即與200 mL冰水混合,抽濾取沉淀,沉淀用30 mL水溶解后用2 mol/L的NaOH溶液中和至中性,用丙酮沉淀后取沉淀,用無水乙醇和丙酮洗3~5次后溶于30 mL純水,加入透析袋透析3~5 d,之后凍干得到O-苯甲酰殼聚糖。

      圖2 O-苯甲酰殼聚糖2的合成路線

      1.2.3 殼聚糖脫乙酰度測定

      根據(jù)文獻[21]的酸堿滴定法,準確稱量0.20 g烘干到恒重的殼聚糖及其衍生物樣品,溶于20.00 mL 0.1 mol/L經(jīng)標定的鹽酸溶液中,加入甲基橙和苯胺藍的混合指示劑,用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定,溶液顏色從紫紅變藍綠色。每個樣品的脫乙酰度測定三次,取平均值為樣品的脫乙酰度。

      1.2.4 殼聚糖衍生物取代度的測定

      (a)N-糖基化殼聚糖的氨基取代度可由以下公式計算:

      (b)通過1H NMR對殼聚糖骨架C2-C6上H以及取代基上的H進行積分,根據(jù)以下公式計算得到N-或O-取代殼聚糖衍生物的修飾率:

      式中:n為取代基上的H的個數(shù)。

      1.2.5 殼聚糖衍生物溶解度的測定

      參照文獻[22]的方法,精確稱取0.05 g殼聚糖衍生物,加入5 mL去離子水,機械攪拌3 h,然后用0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾,未通過濾膜的物質(zhì)干重設(shè)為m1,則這種衍生物的溶解度 =(0.05-m1)/5×100,單位為 g/100 mL。

      1.2.6 表征

      (1)FTIR 光譜

      將樣品研碎后與KBr粉末混合壓片,在紅外光譜儀上進行測定,找出相關(guān)基團的特征吸收峰。

      (2)核磁共振 NMR

      樣品溶于D2O或者D2O和DCl的混合溶劑,作1H NMR。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 FTIR光譜

      圖 3(a)為殼聚糖原料的紅外譜圖,圖中593 cm-1為O-H面外彎曲,665 cm-1為N-H面外彎曲,1083 cm-1為C-OH的伸縮振動吸收峰,1384 cm-1處為CH3的對稱變形振動 (酰胺III帶),1597 cm-1處為氨基N-H的變形振動峰,2873 cm-1為C-H伸縮振動峰,3264cm-1為N-H伸縮振動吸收峰,3425 cm-1為O-H的伸縮振動吸收峰。

      圖3(b)為N-苯甲酰殼聚糖的紅外譜圖,新出現(xiàn)在1633 cm-1處的吸收為二級酰胺 (酰胺I帶)C=O的伸縮振動,出現(xiàn)在1533 cm-1處的吸收為苯環(huán)的骨架振動吸收峰,3264 cm-1處的吸收減弱說明了苯甲酰化發(fā)生在C2-NH2上;1083 cm-1處的吸收峰幾乎沒有變化,說明殼聚糖的-OH不參加反應(yīng)。

      圖3(c)為O-苯甲酰殼聚糖的紅外譜圖,從上至下分別為投料比(殼聚糖:苯甲酰氯)為1:1,1∶2和1∶4的產(chǎn)物。從圖上可以看出:

      (1)當投料比為1∶1時,能夠說明殼聚糖C2-NH2發(fā)生?;磻?yīng)的吸收峰變化為:1637 cm-1處的新吸收峰為二級酰胺(酰胺I帶)C=O的伸縮振動說明有酰胺鍵生成,1597 cm-1處的吸收減弱說明C2的-NH仍在,3264 cm-1處的吸收減弱頁說明C2-NH2上也發(fā)生了苯甲?;徽f明殼聚糖-OH發(fā)生?;磻?yīng)的吸收峰變化為:1715 cm-1處出現(xiàn)的C=O伸縮振動吸收峰說明-OH發(fā)生?;酋;潭炔桓?,1083 cm-1處C-OH的伸縮振動吸收峰遷移至1049 cm-1也說明了這點。說明苯環(huán)存在的變化為:新的苯環(huán)特征吸收峰716 cm-1出現(xiàn)。

      (2) 當投料比為 1∶2時,1720 cm-1處 C=O伸縮吸收變得更強,苯環(huán)吸收峰716 cm-1也變強,出現(xiàn)新的苯環(huán)伸縮振動峰1601 cm-1和684 cm-1,這些都說明DS較投料比1∶1時有所上升。

      (3)當投料比為1∶4時,圖形和投料比1∶2時類似,1548 cm-1處酰胺II帶吸收加強,說明C2-NH2進一步參與反應(yīng),DS在進一步增加。

      (4) 當投料比為 1∶6 時,1720 cm-1處 C=O伸縮吸收進一步加強,3062 cm-1處的苯環(huán)C-H伸縮振動繼續(xù)變強。

      2.2 1H NMR核磁分析

      如圖4所示,1為N-苯甲酰殼聚糖的氫譜(D2O),2為O-苯甲酰殼聚糖的氫譜,且自上往下依次為投料比 (殼聚糖: 苯甲酰氯)1∶1(D2O&CF3COOD),1 ∶2(DMSO),1 ∶4(DMSO)和1∶6(DMSO)的產(chǎn)物的氫譜。

      N-苯甲酰殼聚糖:δ=1.9為乙?;募谆?個 H,δ=2.75為殼聚糖骨架 C3上的 H,δ=3.53~3.80為殼聚糖骨架 C2,C4,C5和 C6上的 5個H,δ=4.86為殼聚糖骨架C1上的一個H,δ=7.34~7.52為苯環(huán)上C2-C4上的3個H,δ=7.67~7.74為苯環(huán)上C1和C5上的2個H。

      O-苯甲酰殼聚糖:(1)1∶1∶δ=1.88為乙?;募谆?個H,δ=3.45~3.96為殼聚糖骨架C2,C4,C5和 C6上的 5個 H,δ=4.75為殼聚糖骨架 C1上的 H,δ=7.2為 N-H,δ=7.40~7.53為苯環(huán)上 C2-C4和 C2’-C4’上的 6個 H,δ=7.80~7.91 為苯環(huán)上 C1,C5,C1’和 C5’上 4 個 H;(2)1∶2~1∶6∶δ=3.00~4.20為殼聚糖骨架上的 7個H,δ=7.2為 N-H,δ=7.40~7.53為苯環(huán)上 C2-C4和 C2’-C4’上的 6個 H,δ=7.80~7.91為苯環(huán)上C1,C5,C1’和 C5’上 4 個 H。

      通過積分計算可得物質(zhì)1的DS為0.52,21∶1的 DS為 0.43,21∶2的 DS為 0.53,21∶4的 DS為 0.75,21∶6的 DS為 1.08。

      2.3 殼聚糖衍生物的溶解性

      圖 3 殼聚糖 0(a),N-苯甲酰殼聚糖 1(b),O-苯甲酰殼聚糖 2(c)的 FTIR 譜圖

      苯環(huán)是一種疏水性基團,微溶于水,溶于大多數(shù)有機溶劑。苯甲?;鶊F的引入能夠阻礙分子內(nèi)和分子間氫鍵的形成,從而改變殼聚糖衍生物的溶解性能。如表1所示,殼聚糖原料只溶于0.2 mol/L AcOH溶液,而DS>0.44的N-苯甲酰殼聚糖開始表現(xiàn)出水溶性,DS為0.52的樣品溶于任何pH值的水溶液,苯環(huán)的作用更類似于一個“物理上的支架”,因此衍生物的溶解性不受pH值的影響,在純水中的溶解度可達10.7 g/L,配成25 g/L的濃度也能夠形成透明的凝膠狀物質(zhì)。所有的N-苯甲酰殼聚糖都不溶于0.5 mol/L NaOH、DMSO、CH3Cl、丙酮、DMF和乙醚,都溶于4.8%LiOH/8%尿素水溶液。N-苯甲酰殼聚糖的DS隨著反應(yīng)溫度和苯甲酰氯投料量的增加而上升,隨著相轉(zhuǎn)移催化劑吡啶的比例增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢,原因是過量的吡啶會造成殼聚糖的析出,從而降低了DS。DS越高的樣品特性粘度越大,原因是苯環(huán)的接入會使得分子與分子之間的作用力變大,從而導(dǎo)致流動性變差。隨著DS的升高,特性粘度也會呈現(xiàn)下降的趨勢,這是因為接枝反應(yīng)導(dǎo)致分子鏈的斷裂從而使得分子量降低,特性粘度也相應(yīng)有所下降。

      O-苯甲酰殼聚糖2的溶解性則較為復(fù)雜,2DS=0.43的樣品能夠部分溶于水和0.5 mol/L NaOH,溶于0.2 mol/L AcOH和4.8%LiOH/8%尿素水溶液,不溶于 DMSO、CH3Cl、丙酮、DMF 和乙醚,溶解后溶液呈淡黃色。2DS=0.53和2DS=0.75的樣品能夠部分溶于水、0.5 mol/L NaOH、CH3Cl和 DMF, 溶于0.2 mol/L AcOH、DMSO和4.8%LiOH/8%尿素水溶液,不溶于丙酮和乙醚,2DS=0.53溶解后溶液呈淡黃色,2DS=0.75溶解后溶液無色透明。2DS=1.08的樣品能夠部分溶于水、0.2 mol/L AcOH、0.5 mol/L NaOH、丙酮、氯仿和4.8%LiOH/8%尿素水溶液,溶于DMSO和DMF,溶解后溶液無色透明。 不難看出,隨著DS的上升O-苯甲酰殼聚糖的疏水性更強,能夠溶于更多的有機溶劑,而在水溶液中的溶解性開始下降。

      圖4 N-苯甲酰殼聚糖1和O-苯甲酰殼聚糖2的1H NMR

      表1 衍生物1和2的DS和溶解性

      3 結(jié)論

      本文通過定向修飾的方法獲得了兩種殼聚糖衍生物N-苯甲酰殼聚糖1和O-苯甲酰殼聚糖2,并對衍生物進行了FTIR、1H NMR表征,證實了這些衍生物的修飾成功。同時更進一步研究了接枝部位及DS對衍生物溶解性的影響,實驗結(jié)果表明:在-NH2上修飾疏水可以阻礙殼聚糖分子內(nèi)和分子間氫鍵的形成,增加殼聚糖的水溶性;在-OH上修飾疏水性基團還能增加殼聚糖的有機溶劑溶解性(O-苯甲酰殼聚糖),該研究為殼聚糖的定向修飾改性提供了一定參考價值。

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